ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 672-677
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:576.3115:577352.3:57723:5771504
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН МИТОХОНДРИЙ КОРНЕПЛОДА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ ПРЕПАРАТА МЕЛАФЕН
© 2007 г. И. В. Жигачева*, Л. Д. Фаткуллина*, А. Г. Шугаев**, И. П. Генерозова**, С. Г. Фаттахов***, В. С. Резник***, А. И. Коновалов***
* Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва ** Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва *** Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова Российской академии наук Казанского научного центра, Казань Поступила в редакцию 02.10.2006 г.
Инкубация митохондрий, выделенных из корнеплодов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), с низкими концентрациями (2 х 10-9 и 4 х 1012 М) препарата мелафен вызывала заметное снижение микровязкости поверхностного липидного бислоя мембран, при этом в 1.4 раза увеличивалась микровязкость в глубоколежащих прибелковых областях липидного бислоя. Препарат не влиял на уровень флуоресценции продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах свежевыделенных митохондрий корнеплода сахарной свеклы и снижал его до контрольных величин в мембранах искусственно "состаренных" митохондрий. Мелафен увеличивал максимальные скорости окисления НАД-зависимых субстратов и эффективность окислительного фосфорилирования, активировал перенос электронов на конечном (цитохромоксидазном) участке дыхательной цепи митохондрий, что, по-видимому, обуславливало активацию энергетических процессов в клетке. Кроме того, увеличение скорости переноса электронов на конечном участке дыхательной цепи митохондрий, вероятно, сопровождалось снижением уровня ПОЛ и предотвращало повреждение мембран митохондрий в условиях стресса. Выдвинуто предположение, что мелафен обладает некоторыми адаптоген-ными свойствами, о чем свидетельствует тот факт, что его действие на энергетику митохондрий зависит от их функционального состояния.
Beta vulgaris - мелафен - дыхательная цепь митохондрий - перекисное окисление липидов - микровязкость липидного бислоя
ВВЕДЕНИЕ
Необходимость обеспечения экологически безопасного использования биологически активных соединений - регуляторов роста и защиты растений - требует глубокого и всестороннего изучения их физиологического воздействия на организм. В настоящее время регуляторы роста растений и другие биологически активные вещества широко применяются в сельском хозяйстве, что дает возможность предотвратить полегание зерновых культур, ускорить прорастание семян и созревание плодов, способствует повышению
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; БСА -бычий сывороточный альбумин; ДК - дыхательный контроль; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ТМФД - тет-раметилфенилендиамин; БССР - карбонилцианид-п-триф-луорометоксифенилгидразон.
Адрес для корреспонденции: Жигачева Ирина Валентиновна. 119991 Москва, ул. Косыгина, 4. Институт биохимической физики РАН. Факс: 007 (495) 137-41-01; электронная почта: zhigacheva@mail.ru
урожайности и качества выращиваемой продукции, увеличивает устойчивость к действию патогенов и паразитов [1-3]. Обработка растений регуляторами роста позволяет получить сдвиги в обмене веществ, которые сходны с теми, которые возникают под воздействием определенных внешних условий (температуры, длины дня и т.д.). Они повышают устойчивость растений к абиотическому стрессу [2-6].
Одним из таких регуляторов роста растений является мелафен, который представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты. Так, предпосевная обработка семян зерновых, зернобобовых, пасленовых культур мела-феном приводила к повышению энергии их прорастания на 5-25%, у пшеницы - к повышению урожайности и изменению аминокислотного состава белка в зерне [7, 8]. С другой стороны, у хлореллы препарат в чрезвычайно низких концентрациях (от 3 х 10-10 до 3 х 10-9 М) на 10-15% увеличивал скорость фотосинтеза и дыхания клеток [8]. Исходя из этих данных, можно было пред-
положить, что влияние мелафеиа иа процессы жизнедеятельности растительной клетки осуществляется в результате воздействия на функциональное состояние мембран, включая и мембраны митохондрий.
Известно, что биологические объекты, в особенности растения, лишенные подвижности, постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных условий окружающей среды. При этом изменение физико-химического состояния мембран лежит в основе неспецифических реакций растений на воздействие факторов внешней среды [9]. При действии стрессовых факторов у растений происходит нарушение ключевых метаболических процессов, в частности, происходит ряд изменений в цепях транспорта электронов в хлоро-пластах и митохондриях, в результате чего усиливается образование активных форм кислорода (АФК) [10-14]. В условиях, когда генерация АФК возрастает, а антиоксидантная система не в состоянии справиться с нарастающим уровнем АФК, в мембранах активируются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) [15, 16]. Активация процессов ПОЛ в митохондриях может привести к увеличению неспецифической протонной проводимости внутренней мембраны, а накапливающиеся продукты ПОЛ - к ингибированию ключевых митохондриальных ферментов: цитохром с-оксидазы, пируватдегидрогеназы, малик-энзима, глициндекарбоксилазы и др. [17].
В связи с этим было необходимо выяснить влияние запатентованного препарата мелафен (патент РФ № 2158735) на физико-химическое состояние мембран, процесс ПОЛ и метаболическую активность митохондрий растений.
МЕТОДИКА
Растения сахарной свеклы (Beta vulgaris L., сорт Верхнячская 031) выращивали в полевых условиях. Митохондрии выделяли из запасающей паренхимы корнеплодов [18]. Регистрацию потребления кислорода митохондриями проводили полярографическим методом, используя поляро-граф LP-7 и кислородный электрод типа Кларка. Стандартная среда инкубации митохондрий содержала: 0.4 М сахарозу, 20 мМ Hepes-Трис-бу-фер (рН 7.2), 5 мМ КН2РО4, 4 мМ MgCl2 и 0.1%-ный бычий сывороточный альбумин (БСА). В качестве субстратов использовали малат (10 мМ) + + глутамат (10 мМ) или сукцинат (5 мМ). При определении скорости переноса электронов на конечном участке ЭТЦ митохондрий среда инкубации митохондрий содержала: 0.4 М сахарозу, 20 мМ Hepes-Трис-буфер (рН 7.2), 5 мМ КН2РО4, 4 мМ MgCl2, 0.1%-ный БСА, 10 мМ аскорбат, 60 мкМ ро-тенон, 5 мкМ антимицин А, 0.5 мкМ карбонилциа-нид-я-трифлуорометоксифенилгидразон (FCCP).
Изучение структурных характеристик мембран митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы проводили методом ЭПР-спектроскопии с использованием парамагнитных спиновых зондов: 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоилоксипиперидин-1-оксил (зонд 1) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксил (зонд 2) [19]. Препарат мелафен в концентрациях 4 х 10-122 х 10-7 М добавляли в суспензию мембран (3-5 мг белка/мл) и инкубировали 30 мин при 4°С. Затем в пробу вводили зонд, конечная концентрация которого была 10-5 М, и инкубировали с митохондриями в течение 30 мин при температуре 4°С. Контролем служили пробы мембран без добавления препарата. Спектры регистрировали на ЭПР-спектрометре ER-200D SRC ("Bruker", Германия) при комнатной температуре. Из полученных спектров по формулам для быстровращающихся зондов рассчитывали время вращательной корреляции зондов (тс 10-10 с), имеющие смысл периода переориентации радикала на угол п/2 [20]. Результаты выражали в относительных единицах (результаты представлены в виде отношения опыт/контроль).
При определении ПОЛ свежевыделенные или искусственно "состаренные" (после 5 ч хранения при 10°С), митохондрии в течение 30 мин инкубировали в стандартной среде (см. выше) без препарата или в присутствии 2 х 10-7 и 4 х 10-12 М мела-фена. Уровень ПОЛ оценивали флуоресцентным методом [21], используя спектрофлуориметр Hitachi MPF-4 (Япония). Длина волны возбуждения флуоресценции - 360 нм, испускания - в полосе 420-470 нм. Для калибровки измеряли стандартную флуоресценцию гуанидинсульфата (1 мкг/мл в растворе 0.1 N серной кислоты, которую принимали за 60 ед. при установке фотоумножителя на 0.3). Результаты выражали в единицах флуоресценции в пересчете на мг митохондриального белка.
Каждый опыт или серию опытов проводили не менее, чем в 5-кратной повторности, в случае полярографических исследований и при измерении флуоресценции и в 3-кратной повторности в случае ЭПР-спектроскопии. Данные, представленные в таблицах, являются средними арифметическими из полученных величин с указанием стандартной ошибки. Для рисунков значимость различий (P) оценивали по /-критерию Стьюден-та [22].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Инкубация митохондрий, выделенных из корнеплодов сахарной свеклы, с препаратом мелафен приводила к изменению структурного состояния мембран митохондрий, регистрируемому методом ЭПР-спектроскопии (рис. 1). При этом микровязкость поверхностного липидного бислоя
л 60 г
50 -
40 -
30 -
& 20-
10 -
£ 0 о
4 х 10-12 2 х 10-9 2 х 10-7 Концентрация мелафена, М
4 х 10-12 2 х 10-11 2 х 10-9 2 х 10-7 Концентрация мелафена, М
Рис. 1. Влияние препарата мелафен на микровязкость митохондриальных мембран.
Условия измерения описаны в разделе МЕТОДИКА. 1 - микровязкость липидного бислоя; 2 - микровязкость прибелковых липидов.
(зонд 1) более всего снижалась при концентрации препарата 4 х 10-12 М (на 10%). В то же время, микровязкость глубоколежащих прибелковых липидов (зонд 2) повышалась при инкубации с мелафеном, и наиболее сильные изменения (на 37%) наблюдали при использовании препарата в концентрации 2 х 10-7 М (рис. 1). По-видимому, описанные изменения микровязкости липидного бислоя объясняются тем, что препарат, являясь физиологически активным веществом, использовался в малых и сверхмалых дозах, имеющих сложную зависимость "доза-эффект" и практически разные по величине эффекты доз, различающихся на 5-8 порядков [23]. Кроме того, снижение микровязкости поверхностного бислоя липидов в присутствии мелафена, по-видимому, обусловлено гидрофильным "хвостом" препарата и его ан-тиоксидантными свойствами.
В этом случае мелафен, изменяя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.