научная статья по теме ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИДА АЗОТА И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ИНДУЦИРОВАННОЙ ТЕПЛОУСТОЙЧИВОСТИ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИДА АЗОТА И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ИНДУЦИРОВАННОЙ ТЕПЛОУСТОЙЧИВОСТИ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 1, с. 72-78

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ОКСИДА АЗОТА И ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ИНДУЦИРОВАННОЙ ТЕПЛОУСТОЙЧИВОСТИ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ © 2015 г. Ю. В. Карпец, Ю. Е. Колупаев, А. А. Вайнер

Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева, Харьков, Украина

Поступила в редакцию 27.03.2014 г.

Исследовали участие оксида азота (NO) и пероксида водорода (Н2О2) в формировании теплоустойчивости, индуцированной одноминутным воздействием температуры 42°С, у 3-суточных проростков мягкой озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Элегия). В течение 2 ч после закаливающего прогрева проростков отмечали повышение содержания NO в корнях. Увеличение количества пероксида водорода в корнях наблюдали в течение 30 мин после воздействия гипертермии. Этот эффект нивелировался при обработке проростков скавенджером оксида азота PTIO (2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide) и ингибитором NO-синтазы L-NAME (N -nitro-L-arginine methyl ester). Обработка проростков антиоксидантами ионолом и диметилтиомочевиной (ДМТМ) угнетала вызываемое закаливанием повышение содержания оксида азота в тканях. При обработке проростков донором оксида азота нитропруссидом натрия (НПН) в них увеличивалось количество эндогенных NO и H2O2; такой же эффект наблюдали при действии экзогенного пероксида водорода. Под влиянием закаливающей температуры и экзогенной обработки НПН и пероксидом водорода повышалась устойчивость проростков к повреждающему прогреву, тогда как антагонисты оксида азота (PTIO и L-NAME) и антиоксиданты (ионол и ДМТМ) препятствовали формированию теплоустойчивости проростков после закаливающего прогрева. Сделано заключение, что при индуцировании теплоустойчивости проростков пшеницы закаливающим прогревом происходит функциональное взаимодействие NO и H2O2 как сигнальных посредников.

Ключевые слова: Triticum aestivum — оксид азота (NO) — пероксид водорода — тепловое закаливание — теплоустойчивость

DOI: 10.7868/S0015330314060098

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что физиологический ответ растительных клеток на действие стрессоров происходит с участием сигнальных посредников — ионов кальция, цАМФ, фосфатидной кислоты, активных форм кислорода (АФК), оксида азота (NO) и др. [1, 2]. Имеются сведения, указывающие на роль пероксида водорода и оксида азота в транс-дукции температурных сигналов в растительных клетках.

Увеличение содержания пероксида водорода зарегистрировано при действии на растения низ-

Сокращения: L-NAME — ингибитор NO-синтазы (NG-nitro-L-arginine methyl ester); PTIO — скавенджер NO (2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide); ДМТМ — ди-метилтиомочевина; НПН — донор NO (нитропруссид натрия).

Адрес для корреспонденции: Колупаев Юрий Евгеньевич. Украина, 62483 Харьков, п/о "Коммунист-1". Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева. Электронная почта: plant_biology@mail.ru

ких положительных температур [3, 4]. Есть основания полагать, что повышение содержания АФК сопряжено с формированием защитных реакций на гипо-, гипертермию и другие абиотические стресс-факторы. Так, на проростках кукурузы показано, что 4-часовое воздействие температуры 1°С с последующим 6-часовым выдерживанием растений при 26°С вызывало транзиторное повышение содержания пероксида водорода в тканях и повышение устойчивости растений к продолжительному действию низких температур [5]. Кратковременное увеличение содержания пероксида водорода показано и после действия на проростки пшеницы высокой закаливающей температуры [6, 7]. Предобработка растений антиоксидантами ионолом и диметилтиомочевиной (ДМТМ), а также ингибитором НАДФН-оксидазы имида-золом препятствовала развитию теплоустойчивости растений и активации антиоксидантных ферментов. В листьях кукурузы увеличение содержания Н2О2 предшествовало увеличению со-

держания АБК и последующей активации анти-оксидантной системы [8]. В связи с этим можно полагать, что АФК являются посредниками, необходимыми для индуцирования реакций, обусловливающих развитие устойчивости растений к стрессовым температурам и водному дефициту.

Есть сведения и об изменениях содержания эндогенного NO у растений при действии абиотических стрессоров. На культуре клеток табака [9] и каллусной культуре тростника [10] показано усиление синтеза NO в ответ на воздействие гипертермии. Подобные эффекты установлены и на растениях арабидопсиса при действии высоких и низких температур [11, 12]. В то же время мало исследованной остается возможная связь между процессами образования NO и формированием устойчивости. В работе Song с соавт. [13] показано повышение содержания оксида азота в листьях риса при двухчасовом действии закаливающей температуры 38°С. Обработка растений скавен-джером оксида азота PTIO (2-phenyl-4,4,5,5-tet-ramethylimidazoline- 1-oxyl-3-oxide) препятствовала развитию их теплоустойчивости. При этом, однако, остается неясным, участвует ли NO в индуцировании устойчивости растений при кратковременном действии высоких температур [7].

Также мало исследована связь между NO и АФК как сигнальными посредниками при подобных воздействиях. В то же время получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что АФК принимают участие в реализации физиологических эффектов NO и наоборот [14]. Так, при обработке растений Hypericum perforatum экзогенным H2O2 увеличивалась генерация NO, а под влиянием экзогенного донора оксида азота нитропруссида натрия (НПН) повышалось содержание эндогенного Н2О2 [15]. В культуре тканей корней женьшеня [16] и в изолированных ко-леоптилях пшеницы [17] под влиянием донора NO усиливалась генерация супероксидного анион-радикала. На растениях H. perforatum показано увеличение содержания пероксида водорода под действием теплового шока, которое частично угнеталось скавенджером NO PTIO [15]. В то же время на растениях бобов эффект экзогенного оксида азота как агента, вызывающего закрытие устьиц, не подавлялся каталазой и реализовывал-ся независимо от уровня АФК [18]. Обработка отделенных листьев кукурузы НПН не приводила к накоплению в них пероксида водорода, хотя экзогенный пероксид водорода вызывал усиление генерации NO [19].

В связи с изложенным целью работы было изучение возможного функционального взаимодействия оксида азота и пероксида водорода при индуцировании теплоустойчивости проростков пшеницы кратковременным воздействием высокой температуры. Для этого исследовали динами-

ку эндогенных H2O2 и NO и влияние антагонистов этих сигнальных посредников на их содержание в корнях интактных проростков после воздействия закаливающих температур, а также на формирование теплоустойчивости проростков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили этиолированные проростки мягкой озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Элегия, выращенные на очищенной водопроводной воде при температуре 22°С. Корни интактных трехсуточных проростков соответствующих вариантов опыта в течение 24 ч выдерживали в растворах скавенджера оксида азота PTIO, превращающего NO в нитрит [20], ингибитора NO-синтазы NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), антиоксидантов ионола (бутилгидрокситолуол) или диметилтиомочеви-ны (ДМТМ). Контрольные проростки в это время продолжали выращивать на воде.

Рабочие концентрации указанных соединений (PTIO - 100 мкМ, L-NAME - 2 мМ, ионол -50 мкМ, ДМТМ - 150 мкМ), которые в значительной степени снижали положительное влияние закаливающего прогрева на теплоустойчивость проростков, подбирали на основании предварительных опытов.

После обработки исследуемыми соединениями часть проростков, помещенных в марлевые мешочки, подвергали одноминутному закаливающему прогреву при температуре 42.0 ± 0.1°С в широких химических стаканах с водой, находящихся в водяном ультратермостате [6, 7]. Затем растительный материал соответствующих вариантов снова переносили на растворы исследуемых эффекторов и выдерживали на них 24 ч до момента тестирующего (потенциально летального) прогрева. Образцы, которые не обрабатывали эффекторами, все время выдерживали на воде.

Как было установлено ранее, максимальная теплоустойчивость проростков развивалась через 24 ч после закаливающего прогрева [7]. В этот момент определяли их теплоустойчивость, подвергая проростки потенциально летальному прогреву в водяном ультратермостате при температуре 46.0 ± 0.1°С в течение 10 мин. Через 4 суток после воздействия повреждающего прогрева оценивали относительное количество выживших проростков [7].

В отдельных сериях опытов исследовали влияние инкубации на растворах донора оксида азота нитропруссида натрия (НПН - 2 мМ) или пероксида водорода (10 мМ) на теплоустойчивость проростков. В этом случае корни интактных проростков 24 ч выдерживали в указанных растворах, после чего определяли их устойчивость к повреждающему прогреву, как описано выше.

(а)

О £

о

и

Я

а

X

р

о д

о О

70 г

60

40

3

4

24

а

В

о о

о <ч

о о

я fe

ЕЙ 0

Й а

* Щ

л °

Й- -Ъ

о л

180

160

140

120i;i

100 -

80

(б)

Время, ч

1234 Время, ч

24

Рис. 1. Динамика содержания оксида азота (а) и пероксида водорода (б) в корнях проростков пшеницы после одноминутного закаливающего прогрева при температуре 42°С. 1 — контроль; 2 — закаливание.

Для биохимических анализов использовали корни интактных проростков. Известно, что корни проростков пшеницы более чувствительны к воздействию гипертермии по сравнению с побегами и удобны для исследований с использованием метода ингибиторного анализа [7].

Содержание NO в корнях и побегах анализировали по методу, описанному Zhou с соавт. [21] с модификациями. В основе метода — превращение содержащегося в растениях NO в нитрит и определение концентрации последнего по реакции Грисса. Навеску свежесрезанного растительного материала гомогенизировали на льду в 50 мМ ацетатном буфере (рН 3.6) с добавлением 2% ацетата цинка. Гомогенат центрифугировали при температуре не выше 4°С при 8000 g в течение 15 мин, затем к 10 мл супернатанта добавляли 250 мг древесного угля. Смесь фильтровали через бумажный фильтр, после чего сме

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком