ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2007, том 54, № 6, с. 820-827
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗНОИ СИСТЕМЫ В МЕЗОФИЛЛЕ И ОБКЛАДКЕ ЛИСТЬЕВ КУКУРУЗЫ В УСЛОВИЯХ
СОЛЕВОГО СТРЕССА
© 2007 г. А. Т. Епринцев, О. С. Федорина
Воронежский государственный университет, Воронеж Поступила в редакцию 11.12.2006 г.
Выявлены особенности формирования адаптивной реакции клеток мезофилла и обкладки листьев кукурузы (Zea mays L.) к условиям солевого стресса на уровне функционирования системы ферментов, участвующих в окислении малата. Исследована работа четырех малатдегидрогеназ (МДГ), входящих в состав системы и установлено, что она направлена на поддержание пулов малата и пирувата, необходимых для функционирования цикла Хэтча-Слека и интенсивно расходуемых на нейтрализацию солевого воздействия. Увеличение активности НАД-МДГ было связано с индуцированным солью синтезом дополнительной изоформы МДГ в клетках мезофилла. В клетках обкладки подобных изменений изоферментного спектра не обнаружили.
Ключевые слова: Zea mays - малатдегидрогеназный комплекс - мезофилл - обкладка - солевой стресс.
ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день одной из основных проблем при возделывании орошаемых земель является их засоление [1]. Соль, попадая в растительные клетки, вызывает в них нарушение тонких биохимических механизмов, определяющих качественное и количественное своеобразие метаболических функций, ход процессов газообмена, гомео-стаз и использование доступных источников энергии [2, 3].
В ответ на действие стрессора (в нашем случае соли) в растительном организме происходят значительные изменения, направленные на нейтрализацию осмотических и токсических эффектов. К ним относятся: изменение ионной проницаемости мембран, синтез осмолитов и осмопротекторов [4], интенсификация энергетического обмена [5, 6], интеграция углеродного и азотного метаболизма [7]. В такой ситуации наибольший адаптационный потенциал имеют растения, относящиеся к С4-типу (кукуруза, сорго, амарант и др.), для которых характерна более сложная морфофизиологическая структура и лучшая приспособленность к условиям современной окружающей среды по сравнению с С3-растениями [8]. В частности, при солевом
Сокращения: ДТТ - дитиотрейтол; МЭ - малик-энзим; МДГ - малатдегидрогеназа; ОАА - оксалоацетат; СДГ -сукцинатдегидрогеназа.
Адрес для корреспонденции: Епринцев Александр Трофимович. 394006 Воронеж, Университетская пл., д. 1. Воронежский государственный университет. Факс: 007 (4732) 20-87-55; электронная почта: bc366@bio.vsu.ru
стрессе у С4-растений выше эффективность физиологических процессов, чем у растений С3-типа, как в отношении квантового выхода фотосинтеза, так и уменьшения расхода воды в ходе транспира-ции [9]. Кроме того, морфологический тип кранц-анатомии листа соответствует проявлению признака суккулентности, что вполне может считаться основной причиной хорошей приспособленности С4-растений к действию соли [9]. Было показано, что длительное засоление способно даже вызывать морфологические изменения в структуре листьев растений этого типа в сторону увеличения суккулентности [9].
Несмотря на большое количество работ, посвященных биохимическим механизмам адаптации, наблюдается дефицит исследований, направленных непосредственно на изучение ответной реакции дифференцированных тканей С4-растений на действие стрессовых факторов. Особый интерес представляют метаболические пути, с помощью которых осуществляется интеграция работы мезофилла и обкладки листьев.
Центральное место в метаболизме растений играет малат [10]. Наличие широкого спектра ферментов, принимающих участие в утилизации этого интермедиата, определяет его роль в поддержании внутренних физиологических условий в клетках при стрессовом воздействии [11]. Важной составляющей клеточного ответа на засоление является синтез осмолитов и осмопротекторов, позволяющих поддерживать осмотический баланс клетки [7]. Некоторые осмолиты (оксалоацетат (ОАА),
аланин) могут быть мобильно синтезированы из ма-лата или пирувата, образующегося при декарбокси-лировании яблочной кислоты. Двойной путь утилизации малата с помощью малатдегирогеназ (МДГ) и малик-энзимов (МЭ) уменьшает зависимость организма от гликолиза при образовании энергии и синтезе углеродных скелетов [11]. Растительная МДГ (малатдегидрогеназная) система представляет собой динамическое равновесие белков, способное четко реагировать на физиологическое состояние и потребности организма, а также на изменения окружающей среды. В ее состав входят четыре дегидро-геназы, две из которых обладают оксидоредук-тазной активностью, а две другие - декарбоксили-рующей [12].
Наиболее изученным ферментом системы, участвующей в окислении малата, является НАД-МДГ (КФ 1.1.1.37), катализирующая превращение малата в ОАА в цикле Кребса. Кроме того, эта МДГ отвечает за синтез малата и ОАА [11, 12]. За счет работы НАД-МЭ (КФ 1.1.1.39) протекает обходной путь окисления малата в тех условиях, когда оксидоредуктазная дегидрогеназа блокируется высоким уровнем ОАА, низким рН или недостаточной концентрацией ацетил-КоА [11, 12]. Этот фермент в присутствии НАД превращает малат в пируват. В цикле Хетча-Слека у растений с малат-ным типом С4-фотосинтеза работают НАДФ-МЭ (КФ 1.1.1.40) и НАДФ-МДГ (КФ 1.1.1.82), которые являются составляющими механизма фиксации и транспорта СО2. Кроме того, первый из этих ферментов осуществляет регенерацию НАДФ-Н для биосинтетических процессов, а второй играет важную роль при переносе в цитоплазму восстановительных эквивалентов, синтезированных в ходе фотофосфорилирования [11, 12]. Установлено, что индуцированные солью изменения в работе ферментов малатдегидрогеназной системы вносят существенный вклад в формирование адаптации клетки к действию стрессора [11], однако неизвестен вклад отдельных составляющих ферментной системы в адаптивную реакцию дифференцированных тканей С4-растений.
Целью нашей работы было изучение роли отдельных компонентов ферментной системы, участвующей в метаболизме малата, мезофилла и обкладки листьев кукурузы в формировании адаптивной реакции к условиям солевого стресса.
МЕТОДИКА
Объектом исследований служили листья 10-дневных проростков кукурузы (Zea mays L.) сорта Воронежская-76, обладающих С4-метабо-лизмом малатного типа, которые выращивали гидропонным методом. Солевой стресс моделировали перенесением проростков в 150 мМ раствор NaCl, поскольку ионы этой соли обладают низкой физиологической активностью в растительных
клетках. Контролем служили образцы, экспонированные в воде. Первую пробу брали перед внесением соли, следующие - через 1, 3 и 6 ч экспозиции.
Ткани кукурузы разделяли механически. Для получения мезофилла листья исследуемых растений растирали в среде выделения без стекла, затем фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали 5 мин при 3000 g. Оставшийся неразрушенным растительный материал гомогенизировали со стеклом в тех же средах и центрифугировали 10 мин при 5000 g. Полученный супернатант представлял собой фракцию клеток обкладки [13]. Для каждого фермента среда выделения была индивидуальной, подобранной в соответствии с их биохимической характеристикой (по [14, с. 68-74] с изменениями):
для НАД-МДГ: 0.1 М Трис-ИС1-буфер, рН 8.0; 10 мМ МеС12 ■ 6Н2О; 4 мМ ЭДТА; 4 мМ дитио-трейтол (ДТТ);
для НАД-МЭ: 0.1 М Трис-ИС1-буфер, рН 7.3; 10 мМ МеС12 ■ 6Н2О; 1 мМ ЭДТА; 10 мМ р-мер-каптоэтанол;
для НАДФ-МЭ: 0.1 М Трис-ИС1-буфер, рН 7.3; 7.5 мМ МеС12 ■ 6Н2О; 4 мМ ДТТ;
для НАДФ-МДГ: 0.1 М Трис-ИС1-буфер, рН 8.0; 1 мМ ЭДТА; 3 мМ в-меркаптоэтанол; 0.5%-ный Тритон Х-100;
для ФЕП-карбоксилазы: 0.1 М Трис-НС1-бу-фер, рН 8.2; 5 мМ МеС12 ■ 6Н2О;
для НАДФ-глицеральдегидфосфатдегидроге-назы: 0.1 М Трис-глициновый буфер, рН 8.5; 5 мМ ЭДТА.
Чистоту разделенных тканей определяли по активности маркерных ферментов - ФЕП-карбокси-лазы и НАДФ-глицеральдегидфосфатдегидрогена-зы, о которой судили по изменению оптической плотности, обусловленному утилизацией или накоплением НАДН. Активность малатдегидрогеназ также определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм [14, с. 68-74]. За единицу ферментативной активности (Е) принимали количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата за 1 мин при стандартных условиях; активность выражали в Е/г сырой массы. Для спектрофотометриро-вания каждого фермента использовали специфические среды:
для НАД-МДГ: 0.1 М Трис-НС1-буфер, рН 8.0; 10 мМ МеС12 ■ 6Н2О; 0.2 мМ НАД-Н; 1 мМ ОАА;
для НАД-МЭ: 0.1 М Трис-НС1-буфер, рН 6.7; 10 мМ МеС12 ■ 6Н2О; 5 мМ малат; 2.5 мМ НАД+;
для НАДФ-МЭ: 0.1 М Трис-НС1-буфер, рН 7.3; 7.5 мМ МеС12 ■ 6Н2О; 50 мМ КаНС03; 0.2 мМ НАДФ; 30 мМ пируват Ш;
для НАДФ-МДГ: 0.1 М Трис-НС1-буфер, рН 8.0; 100 мМ ОАА; 10 мМ НАДФ-Н;
50 45 40
3 35
|30
« 25
& 20 Л
И 10 5
н м S 0
&
(а)
_ --i-- 1
ж— 1'
- 2
1 1 2' |
л н о о м я н н
м <
(б)
^2'
13 Экспозиция, ч
Рис. 1. Динамика активности НАД-зависимых ферментов МДГ-системы клеток мезофилла и обкладки листьев кукурузы в условиях солевого стресса. а - НАД-МДГ, б - НАД-МЭ. 1,2 - контроль; 1', 2' - засоление; 1, Г - мезофилл; 2, 2' - обкладка.
для ФЕП-карбоксилазы: 0.1 М Трис-НС1-бу-фер, рН 8.2; 5 мМ MgC12 ■ 6Н20; 50 мМ NaHC03; 1 Е/мл МДГ; 0.25 мМ НАДН; 10 мМ ФЕП;
для НАДФ-глицеральдегидфосфатдегидрогена-зы: 0.1 М Трис-глициновый буфер, рН 8.5; 50 мМ NaHPO4; 5 мМ Na3A1SO4; 1 мМ НАДФ; 5 мМ ЭДТА.
Для получения субклеточных фракций разделение мезофилла и обкладки осуществляли в среде выделения НАД-МДГ, содержавшей 0.35 М сахарозу. Полученные гомогенаты центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g. Надосадочная жидкость представляла собой цитоплазматиче-скую фракцию [14, с. 13-16]. Осадок, содержавший митохондрии, ресуспендировали в среде без сахарозы с добавлением 0.5%-ного Тритона Х-100, добиваясь таким образом разрушения митохон-дриальной мембраны [14, с. 13-16].
Электрофоретический анализ проводили по Davis [15]. Использовали 8%-ный разделяющий гель и 2%-ный концентрирующий. Электродный буфер представлял собой смесь 0.05 М Трис-гли-цинового буфера, рН 8.3 с 2 мл 1%-ного бромфено-лового синего [16, с. 7-16]
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.