ХИМИЯ ВЫСОКИХ ЭНЕРГИЙ, 2009, том 43, № 6, с. 496-500
^=РАДИАЦИОННАЯ ХИМИЯ =
УДК 541.15:541.14:547.435:547.952
ГАММА- И УФ-ИНДУЦИРОВАННАЯ ДЕСТРУКЦИЯ СФИНГОМИЕЛИНА, ЛИЗОСФИНГОМИЕЛИНА И РОДСТВЕННЫХ ИМ СОЕДИНЕНИЙ
© 2009 г. А. Г. Лисовская*, А. А. Сосновская*, О. И. Шадыро*, М. А. Кисель**, В. А. Николаевич**
*Белорусский государственный университет Беларусь, 220030, Минск, ул. Ленинградская, 14 E-mail: shadyro@open.by **Институт биоорганической химии НАН Беларуси Беларусь, 220141, Минск, ул. Купревича, 5/2 Поступила в редакцию 17.03.2009 г.
Полученные данные по образованию конечных продуктов радиолиза 2-аминоглицерина, лизосфингомие-лина (сфингозинфосфохолина), а также фотолиза №(2-гидроксипропил)гексанамида и сфингомиелина свидетельствуют о реализации процесса радиационно-индуцированной деструкции указанных веществ с разрывом С-С-связи. Сделано предположение, что этот процесс протекает за счет образования и последующего распада N-центрированных радикалов исходных веществ.
Сфинголипиды являются необходимыми компонентами клеточных мембран и играют важную роль в функционировании биосистем. Сфингомие-лин (СМ) содержится в больших концентрациях в плазматических мембранах роговых клеток и чешуйчатых телах эпидермы, составляет ~10% ли-пидов головного мозга [1, 2]. В плазматических мембранах млекопитающих большинство сфинголи-пидов солокализовано с холестерином в определенных участках мембран, названных "липидными раф-тами" [3]. Предполагают, что "липидные рафты", содержащие высокие концентрации СМ, могут быть потенциальным резервом СМ, ведущим к образованию высоких локальных концентраций церамида -участника процесса апоптоза [4]. Лизосфинголипи-ды, такие как лизосфингомиелин (сфингозинфосфо-холин) и сфингозин-1-фосфат, рассматривают как новый класс сигнальных молекул, они образуются при физиологических и патологических процессах, активизируя различные сигнальные каскады [5].
Наибольшее внимание в радиационных исследованиях липидов уделялось глицерофосфолипидам, поскольку они составляют основу биомембран и при облучении могут подвергаться окислению, что усиливает биологическое действие радиации [6-9]. Показано, что при радиолизе сфингомиелина протекает его фрагментация с элиминированием амидов жирных кислот [10]. Этот процесс включает стадии образования а-гидроксилсодержащих углеродцен-трированных радикалов (I) и их последующего распада с разрывом двух Р-связей по схеме:
Як ^ои
X
R? NH'
Як .о.
H Яз
NH2—R3 +
r2 NH
(I)
R2
(1)
Я — СН—СНС13Н27 ,
о
II +
Я2 — — СН20—Р-ОСН2СН21Ч(СН3)3,
0_
Яз — —СОС17Н35 .
Реакция (1) является частным случаем широко распространенного процесса фрагментации, который реализуется при радиолизе биологически важных органических соединений: углеводов, аминокислот и пептидов [11, 12].
В настоящей работе изучены закономерности образования продуктов радиолиза и фотолиза водных дисперсий сфингомиелина и лизосфингомиели-на, растворов серинола, К-(2-гидроксипропил)гекса-намида и показана возможность протекания деструкции сфинголипидов по новому механизму, реализация которого приводит к разрыву С-С-связи в молекулах исходных веществ.
Y
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Используемый в работе сфингомиелин был выделен из головного мозга свиньи способом, описанным в [13, 14], который включает ступенчатую экстракцию растворителями, щелочной метанолиз и последующую колоночную хроматографию. Сфин-гозинфосфохолин получали деацилированием сфингомиелина [15, 16]. Синтез К-(2-гидроксипро-пил)гексанамида осуществляли методом, основанным на ацилировании аминоспирта смешанным ангидридом капроновой и н-бутилугольной кислот в системе растворителей ТГФ-ацетонитрил с добавлением 15 мкл триэтиламина [17]. Для подтверждения структуры синтезированных веществ использовали спектроскопию ХИ- и 13С-ЯМР.
Многослойные липосомы получали диспергированием тонкой липидной пленки в фосфатном буфере [18]. Для этого раствор липидов в хлороформе выпаривали на роторном испарителе, образцы выдерживали под вакуумом не менее 1 ч для полного удаления растворителя. К полученной липидной пленке добавляли определенное количество фосфатного буфера (с = 0.05 моль/л, рН 7.4), который перед использованием продували в течение 45 мин аргоном (99.9%). Смесь встряхивали на мешалке "Vortex" при температуре 50°С в течение 15 мин и полученные многослойные липосомы обрабатывали на ультразвуковой установке UP 200H (частота 24 кГц) в течение 3 мин с амплитудой колебаний 50% и циклом 0.3. Концентрация липидов в полученных липосомах была 2 х 10-2 моль/л. 0.1 М суспензии К-(2-гидроксипропил)гексанамида готовили аналогично.
Для приготовления 0.1 М водных растворов сери-нола ("Aldrich", США) использовали свежеприготовленную бидистиллированную воду. Доведение растворов до необходимых значений рН осуществляли с использованием хлорной кислоты и едкого натра. Кислород из полученных растворов удаляли продувкой аргоном в течение 45 мин.
Приготовленные образцы облучали на у-устаиов-ке с источником излучения 60Со, мощность дозы -(0.49 ± 0.1) Гр/с. Интервал поглощенных доз для растворов серинола и липосом сфингозинфосфохолина составил 0.59-2.94 кГр. УФ-облучение проводили сплошным спектром дуговой ртутной трубчатой лампы высокого давления (ДРТ-100) на расстоянии 20 см от источника света, мощность дозы составляла 4.5 х 1014 квант с-1 мл-1 на длинах волн 230-280 нм. Время облучения для растворов К-(2-гидроксипро-пил)гексанамида составляло 20-150 мин, для липосом из сфингомиелина - 1-5 ч.
Анализ аммиака в растворах серинола проводили методом жидкостной хроматографии, как описано в [19], в качестве элюента использовался Na-цитрат-ный буферный раствор, рН 10.1.
Анализ карбонильных продуктов радиолиза и фотолиза (формальдегида, ацетальдегида, гликоле-
вого альдегида, Р-гидроксипропионового альдегида, гидроксиацетона, дигидроксиацетона) осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе "Shimadzu" с УФ-де-тектором после проведения реакции карбонильных соединений с 2.4-динитрофенилгидразином. Условия хроматографирования: колонка NUCLEOSIL 120-5 С18 (длина 250 мм, внутренний диаметр 4 мм); элюент - метанол-вода (60 : 40); скорость подачи элюента - 0.5 мл/мин; температура - 40°C; детектор - UV-VIS, X = 360 нм; объем вводимой пробы - 4 мкл. При анализе 2-гексадеценаля в качестве элюента использовали раствор метанол-вода (70 : 30), скорость подачи - 0.8 мл/мин.
Анализ насыщенных углеводородов проводили на хроматографе "Shimadzu" с масс-детектором GCMS-QP2010 Plus, использовалась капиллярная колонка EquityTM-5 (длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина слоя жидкой фазы 0.25 мкм).
Радиационно-химические выходы образования веществ рассчитаны из данных по накоплению продуктов радиолиза от поглощенной дозы. Все приведенные данные получены путем усреднения не менее 3 серий экспериментов. В использованном интервале поглощенных доз концентрации продуктов радиолиза увеличивались линейно с ростом дозы облучения.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Родоначальником сфинголипидов является сфин-гозин. Этот аминоспирт содержит в своем составе фрагмент 2-аминоглицерина (серинола). Нами исследован состав и определены выходы продуктов радиолиза деаэрированного 0.1 М водного раствора серинола в зависимости от рН среды (таблица).
Полученные данные свидетельствуют, что основными продуктами радиолиза серинола являются аммиак и различные карбонилсодержащие вещества, которые образуются при дезаминировании и С-С-деструкции исходного соединения. На выход аммиака и других продуктов радиолиза серинола существенно влияет рН исходных растворов. В настоящей работе нас в большей степени интересовало образование продуктов С-С-деструкции сфинголипидов и их моделирующих соединений, потому процесс дезаминирования серинола не обсуждается, аналогичные реакции для аминоспиртов рассмотрены в [11, 20].
Из радиационной химии и химии свободных радикалов а-диолов следует [21], что С-С-деструкция исходных веществ происходит через стадию образования О-центрированных радикалов (II) с последую-
Радиационно-химические выходы О (молекула/100 эВ) образования продуктов радиолиза 0.1 М деаэрированных растворов серинола в зависимости от рН
Продукты рН
3.0 7.4 11.0
КИз 2.08 ± 0.06 2.94 ± 0.05 3.03 ± 0.12
НОСН2СН2СНО 0.20 ± 0.01 0.82 ± 0.06 0.54 ± 0.04
НОСН2С(0)СН3 0 0.03 ± 0.01 0.23 ± 0.01
НОСН2СН(О)СН2ОН 0 0 0.17 ± 0.02
СН2О 0.02 ± 0.01 0.20 ± 0.03 0.40 ± 0.06
СН3СНО 0.01 ± 0.00 0.04 ± 0.01 0.29 ± 0.05
НОСН2СНО 0.015 ± 0.03 0.05 ± 0.04 0.36 ± 0.03
щей их фрагментацией за счет разрыва С-С- и О-Н-связей:
Я2 ОИ КГ ^О
(2)
(II)
Я,С ИОИ + Я2СИ=О
Согласно данным таблицы, склонность серинола к деструкции с разрывом С-С-связи существенно возрастает в щелочных средах (рН 11.0), когда аминогруппа депротонирована. При изучении радиолиза водных растворов алифатических аминов показано [22, 23], что депротонированная аминогруппа в органических соединениях более реакционноспо-собна по отношению к ОН-радикалам. С учетом сказанного выше, образование продуктов деструкции серинола, таких как формальдегид, ацетальде-гид и гликолевый альдегид, может протекать через стадию образования Сцентрированных радикалов молекул исходного вещества:
С13И27СИ=СН
Я'
ОИ
ЧКИ2
Ш2
ИО
ОИ
ИО
МИ ,И
НОСН2(СНШ2 + СИ2=О
ИОСИ2СИ1ЧИ2 ^СЩС^Ш
И2О
-МИГ
-чИГ СИ2СИ"
О
СИ3СИ=О
(3)
(4)
2ИОСИ2СИ1ЧИ
г2 -ИОСИоСИоКИ,
ИОСИ2СИ=1ЧИ
И2О
-МИГ
И2О
-МИГ
ИОСИ2СИ=О
(5)
В данном случае формальдегид образуется в качестве молекулярного продукта на ранней стадии процесса С-С-деструкции серинола и является основным продуктом деструкции. Так как формальдегид в щелочных средах вступает в реакции конденсации, приведенное в таблице значение выхода формальдегида при рН 11.0 может быть занижено.
Реализация аналогичного (3) процесса при радиолизе водных дисперсий лизосфингомиелина должна приводить к образованию 2-гексадеценаля:
С,3Н27СИ=СН
Я'
ОИ
-Я,СИКИ9
С13И27СИ=СИС^О
(6)
у
И
у
О
II +
= — СИ2О—Р-ОСИ2СИ21Ч(СИ3)3.
О
Действительно, при радиолизе лизосфингомиелина образуется 2-гексадеценаль, причем его накоп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.