МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 388-392
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.25.082.261:582.232
GAP1 -ОПЕРОН ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCOCCUS PCC 7942 КОДИРУЕТ ГЛИКОГЕНФОСФОРИЛАЗУ И ИНДУЦИРУЕТСЯ В АНАЭРОБНЫХ УСЛОВИЯХ
© 2004 г. О. А. Кокшарова*' У. Брандт**, Р. Церфф**
*Институт общей генетики им. НИ. Вавилова, РАН, Москва **Брауншвайгский технический университет, Брауншвайг, Германия Поступила в редакцию 09.06.03 г.
Обнаружен новый генный кластер в клетках одноклеточной фототрофной цианобактерии Synecho-coccus PCC 7942. С помощью экспериментов по РНК-ДНК гибридизациии было показано, что ген gapl Synechococcus PCC 7942 экспрессируется в составе оперона. Секвенирование нуклеотидной последовательности, находящейся после gapl гена, позволило идентифицировать открытую рамку считывания, которая может кодировать гликогенфосфорилазу (GlgP). Нуклеотидная последовательность гена glgP была депонирована в базе данных GenBank под номером AF 428099. Показано, что gapl и glgP экспрессируются как один оперон. Экспрессия данного оперона усливается в анаэробных условиях.
Ключевые слова: анаэробный стресс, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гликоген-фосфори-лаза, гликолитические ферменты, оперон, экспрессия генов, цианобактерии
Цианобактерии, древние родственники хлоро-пластов, оксигенные фотосинтетические бактерии, используются исследователями в качестве удобных модельных объектов с целью расшифровки генетических механизмов, контролирующих фотосинтез, азотфиксацию, клеточную дифференци-ровку, азотный, водородный и углеродный метаболизм [1]. У растений хлоропластная и цитоплаз-матическая глицеральдегид-3-фосфатдегидроге-назы (GAPDH) являются главными ферментами цикла Кальвина и гликолиза соответственно. Ци-анобактерия Synechocystis sp. PCC 6803, способная к гетеротрофному росту на глюкозе в темноте, имеет два gap-гена (gapl и gap2) [2]. Несмотря на отсутствие физической компартментализации в прокариотической клетке цианобактерий, гены gapl и gap2 кодируют ферменты, функционально разобщенные и неспособные заменить друг друга: продукт гена gap2 важен для функционирования цикла Кальвина, а продукт гена gapl играет важную роль в гликолизе [2]. Цианобактерии Anabaena variabilis и Synechococcus PCC 7942 обладают тремя gap-генами (gapl, gap2 и gap3) [3, 4]. До настоящего времени особенности функционирования этих генов не изучались.
Целью данного исследования было изучение экспрессии гена gapl в облигатно фотоавтотроф-ной цианобактерии Synechococcus PCC 7942 с помощью метода РНК-ДНК-гибридизации.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: koksharova@vigg.ru;
AN_Safronov@mtu-net.ru).
ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования. Штамм одноклеточной цианобактерии Synechococcus PCC 7942 получен от профессора C.B. Шестакова, кафедра генетики, МГУ. Клетки цианобактерии выращивали при освещенности 1500 лк (неяркий свет) или при 3000 лк (яркий свет) и температуре 28-30°C на среде BGl1 [5] с продувкой воздухом или воздухом, смешанным с 1% C02. Если клеточная суспензия продувалась воздухом с углекислым газом, в среду роста добавляли буфер, содержащий 10 мМ Hepes-NaOH (pH 8.0).
Для создания анаэробных условий использовали 2.5 литровый контейнер фирмы Anaerocult/EA ("Merck"). Колбочки с клетками цианобактерий в жидкой среде помещали в такой анаэробный контейнер. Escherichia coli, штамм XL-1 Blue выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) с соответствующими антибиотиками. B качестве вектора для клонирования использовали pBluescript SK(+) ("Stratagene"). Трансформацию клеток E. coli, селекцию и проверку полученных трансформантов проводили согласно стандартным методикам [6].
Клонирование, секвенирование gapl-glg оперона Synechococcus PCC 7942 и анализ полученных данных. Ген gapl был клонирован из геномной библиотеки Synechococcus PCC 7942, как это описано ранее [4]. Геномный фрагмент, полученный в результате рестрикции геномной ДНК эн-
GAP1--ОПЕРОН ЦИАНОБАКТЕРИИ
389
донуклеазой Sali, и несущий ген gapl, был суб-клонирован в векторе pBluescript-SK+ и секвени-рован с помощью T7 полимеразы (согласно протоколу фирмы "Pharmacia") на автоматическом ДНК Секвенаторе ("Pharmacia"), согласно рекомендациям производителя. Полученные данные анализировали с помощью NCBi GenBank BLAST e-mail server [7], CyanoBase (http://www.ka-zusa.or.jp/cyanobase/).
Депонирование последовательностей. Полученная в ходе работы нуклеотидная последовательность гена glgP была депонирована в базе данных GenBank под номером AF 428099.
Выделение РНК и блот гибридизация по Но-зерну. Общая РНК была экстрагирована из клеток цианобактерии Synechococcus PCC 7942 с помощью TRizol-реагента (Life Technologies Division, invitrogen Corp., Carlsbad, CA) согласно инструкции производителя. Затем образцы РНК подвергали денатурации и разделяли на 1.3% денатурирующем формальдегидном геле (30 мкг/до-рожку геля) в буфере MOPS (40 мМ морфолин-пропансерная кислота (pH 7.0), 10 мМ Na ацетат, 1 мМ ЭДТА) и переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ ("Amersham Pharmacia") согласно стандартным методикам [6]. Концентрацию РНК измеряли спектрофотометрически при 260 нм до нанесения на гель и оценивали по интенсивности свечения бромистого этидия полос рРНК, наблюдаемого под УФ светом. В качестве РНК маркера для определения размеров полученных транс-криптов, был использован РНК маркер в диапазоне 0.28-6.58 kb, ("Promega"). РНК фиксировали на нейлоновой мембране, запекая ее при 80°C в течение 2 ч. Затем мембрану с зафиксированной на ней РНК гибридизовали с ДНК зондами, меченными a-32P при использовании Multiprime DNA labeling system ("Amersham Pharmacia"). Гибридизацию и отмывку мембран проводили согласно описанным методикам [6]. ДНК-зонды получали с помощью ПЦР при использовании специфичных праймеров: для gapl, 5'- GAC CTC GTT CCG CCA AA-3' и 5'- CCG AGC ATC GCC AAT AAAG-3'; для glgP, 5'(+) CCA CCA CGA GCT ACC TCG 3' и 3'(-) CCG TTG CTA GCC CGG G 5'.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В данном исследовании сообщается об обнаружении нового генного кластера, содержащего функциональные гены, кодирующие два важных фермента углеродного метаболизма: глицераль-дегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH) и гликоген-фосфорилазу (GLGP) в клетках фотоавтотроф-ного микроорганизма - цианобактерии Synechococcus PCC 7942. В ходе экспериментов по гибридизации РНК мы обнаружили, что gapl ген экспрессируется в Synechococcus PCC 7942 как протяженная молекула РНК (3.8-4 т.н.) (рис. 1).
gapl-ЗОНД 1 2
glgP-ЗОНД 1 2
M
-3638
M
-3638
Рис. 1. Гибридизация РНК по Нозерну. Суммарная РНК выделена из клеток дикого типа 8упескососсш РСС 7942. В качестве гибридизационных зондов использованы гены ga.p1 и glgP. Клетки росли в течение 2 сут на ярком свету и с 1% СО2 (дорожка 1) и потом были перенесены на 24 ч в анаэробные условия на яркий свет (дорожка 2). Линия М показывает положение маркера молекулярного веса в нуклеотидах.
gapl У~
glgP
4080 п.н.
Рис. 2. Gapl -оперон содержит ген, кодирующий гликоген фосфорилазу.
Sali геномный фрагмент ДНК, который несет gap1 -ген, был субклонирован в плазмиде pBlue-script и обе цепи были секвенированы. Одна длинная открытая рамка считывания была идентифицирована после З'-конца гена gap1 на расстоянии 295 п.н. Сравнение аминокислотной последовательности, кодируемой этой рамкой считывания с данными, имеющимися в базе данных генного банка, позволило выявить значительное сходство ее с гликогенфосфорилазами из различных организмов. Наивысший уровень сходства наблюдался с белками, кодируемыми двумя glg генами одноклеточной цианобактерии Synechocystis PCC 6803. Последовательность Synechococcus PCC 7942 glg имеет 60% идентичных аминокислот (аа) с glg P1 (sll1356) и 63% идентичных аа с glgP2 (sll1367) Synechocystis 6803 [8].
Таким образом, в геноме Synechococcus PCC 7942 два гена (gap1 and glgP) организованы в последовательности gap1-glgP (рис. 2).
Эксперименты по гибридизации РНК по Нозерну позволили обнаружить длинный транскрипт (3.8-4 т.н.) и более короткие молекулы РНК (рис. 1). Длинный транскрипт соответствует
390
КОКШАРОВА и др.
gapl-ЗОНД 12 3
М
-3638
Рис. 3. Гибридизация РНК по Нозерну. Суммарная РНК выделена из клеток дикого типа 8упескососсш РСС 7942. В качестве гибридизационного зонда использован ген ga.p1. Клеточная суспензия цианобак-терий росла в течение 5 сут при низкой интенсивности света (1500 лк) и воздушной атмосфере (дорожка 1) и потом клетки были перенесены на 28 ч в следующие условия: яркий свет (3000 лк) и воздух (дорожка 2), яркий свет и анаэробные условия (дорожка 3), свет низкой интенсивности и анаэробные условия (дорожка 4). Линия М показывает положение маркера молекулярного веса в нуклеотидах.
сумме транскриптов gapl и glgP. Меньшие транскрипты могут быть продуктами деградации РНК. Следует отметить, что экспрессия оперона gapl-glgP Synechococcus PCC 7942 усиливается при инкубации клеток в анаэробных условиях (рис. 3).
Генные кластеры, кодирующие ферменты, участвующие в гликолизе, описаны для некоторых других прокариотических организмов. Так, например, в клетках Escherichia coli гены, кодирующие фруктозо-1,6-бифосфатальдолазу, фосфогли-церокиназу (PGK) и GAPDH [9] образуют один генный кластер, а гены, кодирующие триозофос-фатизомеразу (TPI) и фосфофруктокиназу [10] образуют другой кластер. В клетках Bacillus stearothermophilus GAPDH и фосфоглицерокиназа кодируются соседними генами [11], а в клетках Bacillus megaterium к одному оперону принадлежат гены, кодирующие GAPDH, PGK и TPI [12].
Мы обнаружили новый gap-оперон, который отличается от gap-оперонов из других организмов. Этот новый gap-оперон цианобактерии Synechococcus PCC 7942 содержит gapl и ген, кодирующий гликогенфосфорилазу. Гликоген-фосфорилаза (ADP-глюкозопирофосфорилаза (КФ 2.7.7.27)) важный аллостерический фермент углеродного метаболизма, принимающий учас-
тие в метаболизме бактериального гликогена [13]. Гликоген присутствует в клетках многих бактерий, однако только несколько бактериальных гликогенфосфорилаз были идентифицированы и охарактеризованы на белковом и ген
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.