МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 393-397
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.25.082.261:582.232
GAP3-ГЕН ЦИАНОБАКТЕРИИ SYNECHOCOCCUS PCC 7942 ЭКСПРЕССИРУЕТСЯ В УСЛОВИЯХ АДАПТАЦИИ К НИЗКИМ КОНЦЕНТРАЦИЯМ СО2
© 2004 г. О. А. Кокшарова*' М.-Ф. Лиауд**, Р. Церфф**
*Институт общей генетики им. Н И. Вавилова РАН, Москва **Брауншвайгский технический университет, Брауншвайг, Германия Поступила в редакцию 09.06.03 г.
Цианобактерии Synechococcus и Anabaena обладают геном gap3, функция которого неизвестна. Ранее полагали, что он имеется только у некоторых прокариотических организмов, но недавно этот ген был обнаружен также у эукариот (Qian and Keeling, 2001). С целью выявления условий эспрессии гена gap3 в клетках Synechococcus PCC 7942 были проведены эксперименты с помощью метода РНК-ДНК гибридизации. Было обнаружено, что gap3 ген не экспрессируется в стандартных лабораторных условиях роста цианобактерии. Экспрессия данного гена индуцируется в условиях адаптации клеток к низким концентрациям углерода в условиях яркой освещенности. Показано, что данный ген экспрессируется в виде протяженной мРНК, вероятно, входя в состав оперо-на. Секвенирование прилегающей к gap3 гену последовательности ДНК позволило обнаружить другой ген (1259 п.н.), который перекрывается на 4 нуклеотида с геном gap3. Этот ген может кодировать мембранный белок, имеющий гомологию с белками-транспортерами. Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок-транспортер была депонирована в базе данных GenBank под номером AF 428100.
Ключевые слова: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, оперон, С02-концентрирующий механизм, транспортер, функциональный плейотропизм, экспрессия генов, цианобактерии, gap3.
Хлоропластная и цитоплазматическая глице-ральдегид 3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) являются главными ферментами цикла Кальвина и гликолиза у растений и цианобактерий. Кодирующие их гены (gap-гены) служат молекулярными маркерами при выявлении и изучении эволюционных связей между организмами [1].
Цианобактерии, эволюционно родственные хлоропластам высших растений, имеют два gap-гена (gapl и gap2) в случае Synechocystis sp. PCC 6803 [2] или три gap-гена (gapl, gap2 и gap3) в случае Anabaena variabilis [3] и Synechococcus PCC 7942 [4]. Ген gap3 был обнаружен недавно в эука-риотическом геноме [5]. До сих пор не ясна его функция. Филогенетический анализ позволял предположить, что gap3 имеет генетическое родство gap гену E. coli (gapB) [6], который кодирует эритрозо-4-фосфат дегидрогеназу (E4PDH), а не глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу [7].
Целью данного исследования было обнаружение условий, в которых экспрессируется ген gap3 в клетках Synechococcus PCC 7942. Информация об условиях экспрессии данного гена может дать ключ к пониманию возможной физиологической роли продукта этого гена в клетках цианобактерий.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: koksharova@vigg.ru;
AN_Safronov@mtu-net.ru).
ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования. Культуру одноклеточной цианобактерии Synechococcus PCC 7942, любезно предоставленную проф. C.B. Шестаковым (кафедра генетики МГУ), выращивали при освещенности 1500 лк (неяркий свет) или при 3000 лк (яркий свет) и температуре 28-30°C на среде BG11 [8] с продувкой воздухом или воздухом, смешанным с 1% C02. Если клеточная суспензия продувалась воздухом с углекислым газом, в среду роста добавляли буфер, содержащий 10 мМ Hepes-NaOH (pH 8.0). Клетки дикого типа нитчатой азотфик-сирующей цианобактерии Anabaena variabilis ATCC 29413 (любезно предоставлена профессором Боте, Ботанический Институт, Кельнский Университет, Германия) выращивали, как описано [9].
Escherichia coli, штамм XL-1 Blue выращивали в среде Лурия-Бертани (LB) с соответствующими антибиотиками. B качестве вектора для клонирования использовали pBluescript SK(+) ("Stratagene"). Трансформацию клеток E. coli, селекцию и проверку полученных трансформантов проводили согласно стандартным методикам [10].
М
6583
955
Рис. 1. Гибридизация по Нозерну суммарной РНК из клеток дикого типа Synechococcus РСС 7942. В качестве гибридизационного зонда использован ген gap3. Клетки росли в течение 3 сут на ярком свету с 1% СО2 (дорожка 1) и потом были перенесены на яркий свет и в условия низкого содержания углерода в воздухе (0.03% СО2) на 24 ч (дорожка 2), на 30 ч (дорожка 3), на 36 ч (дорожка 4), на 48 ч (дорожка 5), на 72 ч (дорожка 6). Линия М показывает положение маркера молекулярного веса в нукдеотидах.
Клонирование, секвенирование ORF2 Synecho-coccus PCC 7942 и анализ полученных данных.
Геномный фрагмент, полученный в результате рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой Hindl-II, и несущий ген gap3, был субклонирован в векторе pBluescript-SK + и секвенирован с помощью T7 полимеразы (согласно протоколу фирмы "Pharmacia") на автоматическом ДНК Секвенато-ре ("Pharmacia"), как это описано в соответствующей инструкции.
Полученные данные анализировали с помощью NCBI GenBank BLAST e-mail server [11], Cy-anoBase (http://www.kazusa.or.jp/cyanobase/).
Депонирование последовательностей. Полученная в ходе работы нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок-транспортер, была депонирована в базе данных GenBank под номером AF 428100.
Выделение РНК и блот гибридизация по Нозерну. Общая РНК была экстрагирована из клеток цианобактерии Synechococcus PCC 7942 с помощью TRIzol-реагента (Life Technologies Division, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) согласно инструкции производителя. Затем образцы РНК подвергали денатурации и разделяли на 1.3% денатурирующем формальдегидном геле (30 мкг/до-рожку геля) в буфере MOPS (40 мМ морфолин-пропансерная кислота (pH 7.0), 10 мМ Na ацетат, 1 mM ЭДТА) и переносили на нейлоновую мембрану Hybond-N+ ("Amersham Pharmacia") согласно
стандартным методикам [10]. Концентрацию РНК измеряли спектрофотометрически при 260 нм до нанесения на гель и оценивали по интенсивности свечения бромистого этидия полос рРНК, наблюдаемого под УФ светом. В качестве РНК маркера для определения размеров полученных транс-криптов, был использован РНК маркер в диапазоне 0.28-6.58 kb, ("Promega"). РНК фиксировали на нейлоновой мембране, запекая ее при 80°C в течение 2 ч. Затем мембрану с зафиксированной на ней РНК гибридизовали с ДНК зондами, меченными a-32P при использовании Multiprime DNA labeling system ("Amersham Pharmacia"). Гибридизацию и отмывку мембран проводили согласно описанным методикам [10].
ДНК-зонды получали с помощью полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) при использовании специфичных праймеров: для gap3 Synechococcus PCC 7942 5'-GAA CCC TAC GGT GAG GC-3' и 5'- ATC ACG CGT GTG GAC AC-3'; для gap3 гена Anabaena variabilis ATCC 29413, 5'- GCA GGA ACA GTA TTT TCT G-3' и 5'- CGT TAA TAC CTG ATA CCC A-3'.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Цианобактерии Synechococcus и разные штаммы Anabaena имеют gap3 ген, третий дивергентный цианобактериальный GAPDH ген с неизвестной функцией [3, 4, 12]. Нас заинтересовал вопрос о том, какова возможная роль гена gap3 в клетках цианобактерий. С целью поиска условий, в которых происходит экспрессия гена gap3 в цианобактерии Synechococcus, были осуществлены эксперименты по гибридизации РНК по Нозерну. Суммарная РНК была выделена из клеток цианобактерии, выращенных в разных условиях. Эксперименты по гибридизации РНК не позволили выявить никакой экспрессии гена gap3, если клетки выращивали в стандартных условиях роста в лаборатории (яркий свет, воздух). Уровень экспрессии гена gap3 был очень низким, если вообще различимым, если клетки выращивали в присутствии высокой концентрации CO2 (1% в воздухе) на ярком свету. Неожиданно было обнаружено, что если клетки, выращенные в присутствие высокой концентрации CO2 (1%) на ярком свету, перенести в условия низкой концентрации CO2 (0.03% CO2, уровень в атмосферном воздухе) на ярком свету, появляется длинная молекула мРНК (рис. 1). Экспрессия gap3 в составе длинной мРНК становится видимой после 30 ч с того момента, как клетки были перенесены в условия низкой концентрации углекислого газа (рис. 1). Меньшие транскрипты могут быть продуктами деградации длинного транскрипта.
Гибридизация РНК по Нозерну в опытах, где использовался другой вид цианобактерий, Anabaena variabilis ATCC 29413, позволила обнаружить сходные закономерности. Ген gap3 экспрес-
GAP3-YEU ЦИАНОБАКТЕРИИ
395
сировался как моноцистронная мРНК в неизменных условиях роста (1% C02, яркий свет) и выглядел как длинная мРНК в ходе адаптации клеток к низкой концентрации C02 на ярком свету (рис. 2). Однако появлялся этот транскрипт несколько раньше, чем в клетках Synechococcus и выглядел довольно стабильным, не образуя продуктов деградации в условиях нашего эксперимента. Обнаружено также, что наличие или отсутствие активного процесса азотфиксации в клетках этой азотфиксирующей цианобактерии не сказывается на экспрессии gap3. Длинный транскрипт появлялся после переноса клеток в условия низкой концентрации углекислого газа как в среде без азота, так и в среде, содержащей нитрат натрия (данные не приводятся).
В результате секвенировния последовательности ДНК, окружающей gap3 ген Synechococcus, была обнаружена открытая рамка считывания, ORF2. Эта рамка простирается на 1259 п.н. в длину. ORF2 кодирует гидрофобный белок с молекулярным весом 44584 Да. Программа Blast search позволила выявить гомологию между ORF2 и гипотетическим мембранным 53.1 кДа белком E. coli, который является интегральным мембранным белком, относящимся к PTR2 семейству транспортеров. Существует гомология между этой ORF2 и кодирующей транспортер рамкой считывания (alr10966) цианобактерии Anabaena sp. PCC 7120 [13] и транспортным белком (cephamycin export protein) Rhodobacter capsulatus SB 1003 [14]. Любопытно, что в Synechococcus PCC 7942 gap3 ген и ORF2, кодирующая "транспортный" белок, перекрываются 4 пн как и в случае gap гена и гена, кодирующего транспортный белок в Rhodobacter capsulatus. В Anabaena sp. PCC 7120 gap3 ген, alr1095 (NP_485138.1) и alr1096 (NP_485139.1) также соседи и, вероятно, принадлежат к одному оперону
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.