научная статья по теме ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ЭПИБАТИДИНА И ЕГО БИОМАРКЕРА В ПЛАЗМЕ КРОВИ Химия

Текст научной статьи на тему «ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ЭПИБАТИДИНА И ЕГО БИОМАРКЕРА В ПЛАЗМЕ КРОВИ»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 543.544.54.07/08

ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ЭПИБАТИДИНА И ЕГО БИОМАРКЕРА В ПЛАЗМЕ КРОВИ

© 2015 г. И. Н. Станьков*, В. Б. Кондратьев*, И. Д. Деревягина*,1, П. В. Казаков*, О. И. Лукашов*, О. Т. Морозова*, Ф. М. Семченко**, А. В. Соснов***

*Государственный научно-исследовательский институт органической химии и технологии

111024 Москва, шоссе Энтузиастов, 23 Е-таИ: irinagosnii@gmail.com **Государственный завод медицинских препаратов 111024 Москва, шоссе Энтузиастов, 23 ***Федеральный научно-технический центр метрологии системы экологического контроля «Инверсия»

107031 Москва, ул. Рождественка, 27 Поступила в редакцию 21.11.2013 г., после доработки 05.04.2014 г.

Разработана методика определения 2-эндо-(6'-хлорпиридин-3'-ил)-7-азабицикло-[2.2.1]гептана (эпибатидин) и 2-эндо-(6'-хлорпиридин-3'-ил)-7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ола (биомаркер эпиба-тидина) в плазме крови на уровне 1 х 10-5— 1 х 10-3 мг/мл. Методика основана на извлечении компонентов из плазмы крови жидкостно-жидкостной экстракцией и газохроматографическом определении с использованием термоионного или масс-спектрального детекторов. С целью снижения предела обнаружения эпибатидина и его биомаркера при использовании масс-спектрометрическо-го детектора в методику включена стадия дериватизации с помощью М,0-бис(триметилсилил)три-фторацетамида или 2,3,4,5,6-пентафторбензилбромида.

Ключевые слова: капиллярная газовая хроматография, эпибатидин, биомаркер, неопиоидный анальгетик, терапевтическая доза.

DOI: 10.7868/S0044450215020164

Эпибатидин (CnH13N2Cl) — 2-эндо-(6'-хлорпи-ридин-3'-ил)-7-азабицикло[2.2.1]гептан — алкалоид, неопиоидный анальгетик. Выделенный в 1992 г. из экстракта кожи эквадорской древесной лягушки Epipedobates tricolor (—)-эпибатидин оказался сильным агонистом нейрональных никотиновых рецепторов и проявил в 200—500 раз более высокую анальгетическую активность, чем морфин. Природный (—)-эпибатидин имеет строение 1^,2^,4^-2-(6'-хлор-3'-пиридил)-7-азабицикло[2.2.1]-гепта-на в виде эндо- и экзо-изомеров [1]:

И.

N

N Cl Эндо-эпибатидин (I)

Cl

Экзо-эпибатидин (II)

В концентрациях, превышающих терапевтическую дозу 8—16 мкг/кг, оказывает паралитическое действие на организм [2]. Актуальна проблема надежного определения не только эпибатидина,

но и его биомаркера в биологических материалах. Биомаркер является результатом взаимодействия биологической системы с компонентом окружающей среды. В случае интоксикации препаратом биомаркеры, как правило, присутствуют в легкодоступных тканях, таких как кровь, клетки ротовой полости, моча, из которых их необходимо извлечь и качественно или количественно определить [3—5]. В качестве биомаркера исследован продукт метаболизма эпибатидина в биологическом объекте 2-эн-до-(6'-хлорпиридин-3'-ил)-7-азабицикло[2.2.1]геп-тан-7-ол, который обнаружен ранее при изучении метаболизма эпибатидина in vitro [6].

Цель настоящего исследования — разработка методики газохроматографического определения эпибатидина на уровне 1 х 10-5% и установление наличия биомаркера эпибатидина в плазме крови.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Реагенты. Лабораторные образцы эндо-эпиба-тидина (не содержат экзо-изомер) и эндо-биомар-кера с содержанием основного вещества 97—98 и

Таблица 1. Влияние условий экстракции на степень извлечения эпибатидина (I) и биомаркера (II) из плазмы крови (введено 0.001 мг I и 0.002 мг II, п = 3)

Экстрагент t, мин Уэк, мл Соль Ссоли, г/л R, %

I II

Гексан 15 1.0 - - 10 7

Ацетонитрил 10 1.0 NaCl 360 15 10

Гексан—изопропанол (2 : 1) 15 1.0 (NH4)2S04 780 60 53

Гексан—изопропанол (1 : 1) 10 1.0 К2СО3 1200 95 90

10 1.0 К2СО3 600 97 93

92—95% соответственно характеризовали методами ЯМР-спектроскопии и хромато-масс-спек-трометрии. ^0-бис(триметилсилил)трифтора-цетамид (БСТФА) фирмы Acros organics 98%; 2,3,4,5,6-пентафторбензилбромид фирмы Merk, Германия. В качестве высаливателей использовали насыщенные водные растворы K2C03, (NH4)2S04 марки х. ч. Применяли гексан, изопропанол, ацето-нитрил, метанол (все ч. д. а.), деионированную воду. Экстрагент — смесь гексан—изопропанол 1 : 1 (по объему).

Аппаратура. Газохроматографический анализ проводили на хроматографе фирмы Hewlett-Packard, модель 6890 с программным обеспечением НР-GC Chemstation, снабженном термоионным (ТИД) и масс-спектрометрическим (МС) детекторами. Применяли кварцевые капиллярные колонки НР-1 (15 м х 0.32 мм х 0.25 мкм) с неподвижной жидкой фазой (НЖФ) 1% фенил-, 99% метилсиликон и НР-5 МС (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм) с НЖФ 5% дифенил-, 95% диметилполисилоксан. Использовали аналитические весы (Mettler Toledo CmbH, Швейцария) с дискретностью измерения 0.2 мг, ультразвуковую ванну, модель 2510 (Branson, США), установку для получения де-ионированной воды Водолей (НПП "Химэлектро-ника", Россия), дозатор пипеточный с переменным объемом доз одноканальный (ЗАО "Termo Fisher Scientific", Санкт-Петербург), центрифугу Centra MP-4R (IEC, Needhem Heights, MA 02494, США).

Условия проведения хроматографического анализа. ТИД: температура испарителя 270 ± 1°C, детектора 290 ± 1°C, термостата колонок начальная 100 ± 1°C, конечная 270 ± 1°C, скорость программирования температуры термостата колонок 25 град/мин, расходы (мл/мин) газов-носителей: гелия — 3.5 ± 0.1, водорода — 3.5 ± 0.1, воздуха — 55 ± 0.1.

МС: ионизация электронным ударом, энергия ионизации 70 эВ, диапазон сканирования масс 30—650 m/z, напряжение в источнике ионов 1900 В, температура источника ионов 250 ± 1°C, температу-

ра квадруполя 150 ± 1°С, время задержки на растворитель 3 мин, скорость сканирования 0.5 с на декаду массовых чисел, частота сканирования 2.86 циклов/с, режим сканирования по полному ионному току, температуры испарителя 250 ± 1°С, термостата колонок начальная 60 ± 1°С, выдержка при 60°С 0.5 мин, конечная 270 ± 1°С, скорость программирования температуры термостата колонок 15 град/мин, расход газа-носителя (гелий) 1.0 ± 0.1 мл/мин.

Методика определения эндо-эпибатидина в плазме крови. Во флакон с помощью автоматического дозатора отбирают 1.0 мл анализируемой плазмы крови, добавляют 1.0 мл экстрагента, 1 мл насыщенного водного раствора К2С03. Флакон герметизируют, содержимое перемешивают и помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин, затем центрифугируют в течение 3 мин при скорости 2800 об/мин. Органический слой отбирают в пробоотборник и хроматографируют. Продолжительность определения эпибатидина в плазме крови 40 мин.

Методика определения эпибатидина в виде си-лильной или пентафторбензильной производных.

Аналит извлекают из плазмы крови по методике, описанной выше. Отобранный органический слой упаривают досуха в токе азота при 40°С. К сухому остатку добавляют 0.1 мл 20%-ного раствора БСТФА в ацетонитриле, выдерживают в течение 20 мин при 60°С и хроматографируют. К сухому остатку добавляют 0.09 мл ацетонитрила и 0.01 мл 2,3,4,5,6-пентафторбензилбромида, помещают в ультразвуковую ванну на 20 мин и хроматографируют. Продолжительность определения эпибатидина в плазме крови 70 мин.

Концентрации эпибатидина рассчитывали по методу абсолютной градуировки. Погрешность определения массовой концентрации эпибатиди-на не превышает 30% [7].

I, отн. ед.

280000 -

240000 -

200000 -

160000 -

120000 -

80000 " 41

40000

I, отн. ед. 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000

(а)

69

170

115

89

102

щ

128

151

140

и

205

191

40 60 80

226 238 253 269 285 т"-1-^-г-^

100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

ш/г

(б)

157

50 100 150 200 250 300 350 400 450

500 ш/г

Рис. 1. Масс-спектры 2-эндо-(6'-хлорпиридин-3'-ил)-7-азабицикло-[2.2.1]гептан-7-ола (0.1 мг/мл) (а) и О-триметил-силил-2-эндо-(6' -хлорпиридин-3'-ил)-7-азабицикло[2.2.1]гептан-7-ола (С^^И^СТ^ЗЮ, мг/мл) (б), полученные в режиме полного ионного тока.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Наличие в молекуле эпибатидина двух атомов азота (I и II) позволяет предположить, что азотно-фосфорный детектор кроме селективности обеспечит высокую чувствительность по отношению к аналиту. Предварительные эксперименты показали, что чувствительность ТИД к эндо-эпибати-дину составляет 3 х 10-8 мг, МС-детектора в режиме избранных ионов 3 х 10-6 мг, в режиме сканирования по полному ионному току 1 х 10-4 мг во введенной пробе. Однако масс-спектрометриче-ский детектор более информативен, чем ТИД.

Известно, что для повышения чувствительности детектирующего устройства используют получение производных [8]. С этой целью эпибати-дин обрабатывали силилирующим (БСТФА) или алкилирующим (2,3,4,5,6-пентафторбензилбро-мид) реагентами. При этом чувствительность

МС-детектора по силильному производному составила 4 х 10-7 мг в режиме мониторинга избранных ионов, по пентафторбензильному — 1 х 10-7 мг.

При определении содержания веществ в различных средах (воздух, вода, почва, биообразцы и т.д.) на уровне 10-5—10-6% инструментальными методами как правило требуется их извлечение и

Таблица 2. Данные об устойчивости эндо-эпибатидина в плазме крови при хранении при (4 ± 1)°С

Введено, Найдено, мг

мг 20 мин 120 мин 18 ч 24 ч

0.001 0.00095 0.00086 0.00083 0.00085

0.0005 0.00046 0.00043 0.00042 0.00040

2

t, мин

Рис. 2. Хроматограмма по полному ионному току искусственной смеси, содержащей эндо- и экзо-изомеры эпибатиди-на и 2-эндо-(6 '-хлорпиридин-3 '-ил)-7-азабицикло-[2.2.1]-гептан-7-ол на кварцевой капиллярной колонке HP-5MS (30 м х 0.25 мм х 0.25 мкм), условия хроматографирования приведены в тексте: 1 — экзо-эпибатидин (0.2 мг/мл), 2 — эндо-эпибатидин (0.9 мг/мл), 3 — 2-эндо-(6 '-хлорпиридин-3 '-ил)-7-азабицикло-[2.2.1]-гептан-7-ол (0.1 мг/мл).

концентрирование [9]. Для извлечения эпибати-дина из плазмы крови, не содержащей анальгетика, применяли жидкостно-жидкостную экстракцию с использованием различных экстрагентов и высаливателей. С этой целью в 1 мл плазмы вносили 0.1 мл раствора эндо-эпибатидина в изопро-паноле с концентрацией 0.01 мг/мл и проводили экстракцию и хроматографирование с ТИД. Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что в качестве экстрагента эпи

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком