БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 4, с. 427-431
УДК 57.017.35
ГЕН agi НЕОБХОДИМ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЛАВНИКОВ
У РЫБЫ Danio rerio
© 2015 г. И. Н. Шандарин*, А. С. Иванова*, А. А. Минин**, М. Б. Терешина*, А. Г. Зарайский*, *
*Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва Поступила в редакцию 13.01.2015 г. Принята к печати 06.02.2015 г.
На модели регенерации хвостового плавника рыбы Бато гвпо впервые установлено, что секретиру-емый белок — — необходим для регенерации. Показано, что ампутация хвостового плавника индуцирует быструю активацию экспрессии гена этого белка в клетках раневого эпителия. Вместе с тем, ингибирование трансляции мРНК ag1 вызывает замедление регенерации. Результаты этой работы важны потому, что ген ag1 имеется только у низших, хорошо регенерирующих позвоночных, включая рыб и амфибий, но отсутствует у высших позвоночных, не способных к эффективной регенерации конечностей. Полученные данные свидетельствуют о том, что снижение потенциальной возможности регенерации у высших позвоночных, в том числе у человека, может объясняться исчезновением у них некоторых генов, важных для регенерации, в частности, гена ag1.
Ключевые слова: Бато гвпо, регенерация, ag1.
БОТ: 10.7868/80132342315040120
ВВЕДЕНИЕ
Семейство генов agг включает три подсемейства ag1, agг2 и agг3, гены которых кодируют сек-ретируемые белки, содержащие тиоредоксино-вый домен и регулирующие клеточный рост и дифференцировку [1]. Ранее мы показали, что гены подсемейства ag1 имеются только у низших позвоночных животных (рыб и амфибий), обладающих высокой потенциальной возможностью регенерации, но были утрачены в ходе эволюции у высших позвоночных (рептилий, птиц и млекопитающих), не способных к регенерации конечностей [2] (см. также филогению семейства генов agг на рис. 1а). В этой же работе мы продемонстрировали активацию экспрессии гена ag1 при регенерации хвоста и задней конечности у головастиков шпорцевой лягушки. Данное обстоятельство указывает на важность гена ag1 для регенерации, а также свидетельствует в пользу гипотезы о том, что его утрата в ходе эволюции могла быть одной из причин снижения регенерацион-ных способностей у высших позвоночных. В настоящей работе мы проверили эти предположения, изучив экспрессию и физиологическую функцию гена ag1 при регенерации хвостового плавника у представителя другой большой группы низших позвоночных — рыбы Danio гвпо.
#Автор для связи (тел.: +7 (916) 848-30-16; эл. почта: azaraisky@yahoo.com).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ экспрессии гена ag1 (ag1-a) рыбы Danio rerio проводили с помощью метода гибридизации in situ с меченной дигоксегенином антисмысловой РНК-пробой (dig-проба) к мРНК гена ag1 D. rerio на целых хвостовых плавниках взрослых рыб, которые фиксировали по стандартному протоколу на 1-ый день после ампутации (1 дпа). В результате мы обнаружили существенное усиление сигнала гибридизации в регенератах по сравнению с интактной частью плавника рис. 1б. Как было установлено с помощью гистологических срезов плавников, подвергнутых гибридизации, транскрипты ag1 были преимущественно локализованы в клетках раневого эпителия регенерирующего плавника. Интересно, что такая локализация транскриптов ag1 D. rerio хорошо согласуется с полученными нами ранее данными об аналогичной локализации транскриптов ортолога этого гена, xag1/2, в регенерирующих хвостах и почках задних конечностей головастиков шпорцевой лягушки Xenopus laevis [2]. В свою очередь, это обстоятельство указывает на возможное сходство функций, выполняемых белком Ag1 при регенерации придатков тела у рыб и амфибий.
В качестве альтернативного метода анализа экспрессии ag1 D. rerio в процессе регенерации мы использовали метод ПЦР в реальном времени. Образцы плавников с сформировавшейся бластемой (по 5 фрагментов плавников от разных рыб в 3 повтор-
428
ШАНДАРИН и др.
Ш«1 i
uv Щ я>'
V" 1
1 V,
щ
1
ir ^ ■
i ! 4
V «
) < i
H'
Ir ' -t (в)
Рис. 1. Филогения генов семейства Agr и локализация экспрессии гена ag1 в хвостовом плавнике Danio rerio. (а) Филогенетическое древо белков Agi, Agr2 и Agr3. Расшифровка сокращений: Homo — Homo sapiens; Gal — Gallusgallus; Pel — Pelodiscus sinensis; Ano — Anolis carolinensis; Xen — Xenopus laevis; Amb — Ambystoma mexicanum; Ana — Anasplatyrhynchos; Not — Notophthalmus viridescens; Dan — Danio rerio; Gas — Gasterosteus aculeatus. (б) In situ-гибридизация хвостового плавника Danio rerio на 1-й день после ампутации (1 дпа); правая половина взята в качестве интактного контроля; стрелками показана локализация мРНК ag1. (в) Продольный срез плавника на 1дпа; стрелки обозначают локализацию мРНК ag1.
ГЕН agí НЕОБХОДИМ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЛАВНИКОВ
429
ностях) были собраны на тех же сроках, что и в опытах по гибридизации in situ (рис. 2а). В качестве контроля использовали аналогичные образцы, взятые сразу после ампутации. Суммарную РНК выделяли из собранных образцов с помощью коммерческих наборов компании "Macherey-Na-gel" (США). Синтез первой цепи кДНК и ПЦР в реальном времени полученных образцов РНК проводили с помощью коммерческого набора компании "Евроген" (Россия). Для нормализации данных использовали геометрическое среднее от данных, полученных в результате ПЦР в реальном времени тех же образцов с праймерами к мРНК двух генов "домашнего хозяйства" D. rerio: odc (ген орнитиндекарбоксилазы [3] и ef1a (ген фактора элонгации трансляции 1 альфа). Также, в качестве положительного внутреннего контроля, мы проводили ПЦР в реальном времени с праймерами для двух генов igf2b и fgf20a D. rerio, активация экспрессии которых была показана ранее другими авторами [4, 5].
Как показано на рис. 2б, экспрессия ag1 D. rerio существенно возрастает на 2-й день после ампутации и к пятому дню достигает своего максимального значения, что согласуется с нашим предположением об участии этого гена в регенерации. Полученные данные в целом напоминают картину экспрессии xag1/2 у шпорцевой лягушки [2]. Характер экспрессии маркерных генов igf2b и fgf20a D. rerio в наших экспериментах хорошо согласует-
ся с литературными данными [4, 5], что позволяет говорить о достоверности наших результатов.
Чтобы продемонстрировать непосредственное участие agí D. rerio в регенерации хвостового плавника мы подавили трансляцию мРНК agí с помощью микроинъекций в одну половину плавника антисмысловых морфолиновых олигонук-леотидов, комплементарных области мРНК agí D. rerio, включающей стартовый кодон, и способных проникать через клеточные мембраны (VivoMO agí). В результате мы обнаружили, что микроинъекции VivoMO agí вызывают асимметрию хвостового плавника (рис. 2в, 2г) и значительно замедляют регенерацию (рис. 2д).
Таким образом, наши данные подтверждают участие гена agí в регенерации хвостового плавника D. rerio.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Ампутацию плавников проводили с помощью микрохирургических ножниц. Dig-пробу синтезировали in vitro с помощью SPó-полимеразы и стандартного набора реактивов (Boehringer, Германия), на основе кДНК agí D. rerio, предварительно клонированной в плазмиду T-Gem (Promega, США). кДНК agí D. rerio была получена в результате проведения ПЦР с обратной транскрипцией суммарной РНК из эмбрионов Danio rerio (на стадии 48 ч после оплодотворения) с помощью следующих праймеров (все праймеры 5'—3'):
Agí forward: ATGAATTCTTATGAAATTCTGAAGACA; Agí reverse: GAGTCGACGATCAGAGTTCAGTCTGC.
Полученный фрагмент кДНК клонировали в Для проведения ПЦР в реальном времени ис-плазмиду T-Gem (Promega). пользовали следующие праймеры:
DAg1 forward CACTGGCCGCTCTGTATACTT; DAg1 reverse CTCTTGAGAGAGTTTGGACTGT. ODC forward CTCCACCTTCAATGGCTTCCAG; ODC reverse AGTGGGATGGCACGTTTCCAG; EF-1alpha forward AAGAACGTGTCAGTCAAGGACAT; EF-1alpha reverse CGTAACCCTGAGAGATCTGACCA; Fgf20a forward AAGGGCGAACTGTACGGAT; Fgf20a reverse TTGAGGGCTACATAATAAT; Igf2b forward GCAGGTCATTCCAGTGATGC; Igf2b reverse TCTGAGCAGCCTTTCTTTGC. Vivo-морфолиновые олигонуклеотиды компании "GeneTools" (USA) имели следующую структуру: DAg1 VivoMO ACAGAGCGGCCAGTGCTGCATGATT; control VivoMO TCTGTGGATGTCTTGCTCTTCCAGG.
430
ШАНДАРИН и др.
Образец сразу после ампутации в качестве контроля
Выделение мРНК
Обратная транскрипция
ПРЦ
в реальном времени
Бластема
образец с бластемой после ампутации
2.0
1.8
^
§ 1.4
и
1.2 ые 1.0 I 0.8 § 0.6 * 0.4 0.2
ag1
1
0 1
Экспрессия генов после ампутации
1
5
Дни
20 18
Й16
ни14 и
12
е ы н в о л с
10
fgf20a
*
1 2 5 Дни
10 -
ы8 ц
и
я 7 и
еди6
ые 5 ы вн4
о
л3 с3
о
igf2b
оМЛ
1 2 5 Дни
(б)
Внутренний контроль Контрольные УпоМО
Первый день после ампутации
п = 12
Контр. ag1 ПуоМО ИуоМО
Второй день после ампутации
13
Контр. ag1 ИуоМО ИуоМО
бластемы
9
*
*
1
2
п
Рис. 2. Изучение экспрессии гена ag1 и влияния подавления трансляции мРНК ag1 на регенерацию. (а) Схема постановки эксперимента ПЦР в реальном времени (подробнее см. в тексте). (б) Характер экспрессии ag1, fgf20a, igf2b Б. гвпо в контрольных образцах сразу после ампутации и на 1, 2, 5 дпа (*р < 0.01). (в, г) Регенерирующие хвостовые плавники на 2 дпа; инъекции контрольных УпюМО или ag1 УпюМО производились в правую половину плавника. (д) Графики, отражающие высоту наросшей бластемы (к, мм) на 1 и 2 дпа(*р < 0.01); справа схема подсчетов (£ — площадь бластемы, Ь — ширина плавника).
ГЕН agí НЕОБХОДИМ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПЛАВНИКОВ
Подсчеты длины наросшей бластемы проводили в программе ImageJ по схеме, представленной на рис. 2д.
БЛАГОДАРНОСТИ
Данная работа была выполнена за счет средств комплексной научной программы Российского Фонда Фундаментальных Исследований 14-50-00131.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Fritzsche F.R., Dahl E., Pahl S., Burkhardt M, Luo J., Mayordomo E, Gansukh T., Dankof A., KnuechelR., Den-
431
kert C, Winzer K.-J, Dietel M, Kristiansen G. // Clin. Cancer Res. 2006. V. 12. P. 1728-1734.
2. Ivanova A.S., Tereshina M.B., Ermakova G.V., Belou-sov V.V., Zaraisky A.G. // Sci. Rep. 2013. V 3. P. 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.