ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.143:575.143
ГЕН ВЕРНАЛИЗАЦИИ FRIGIDA У КУЛЬТУРНЫХ ВИДОВ Brassica
© 2014 г. О. А. Фадина, Э. Е. Хавкин
Государственное научное учреждение Всероссийский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской
сельскохозяйственной академии, Москва Поступила в редакцию 18.11.2013 г.
Среди генов, контролирующих переход арабидопсиса к цветению по пути вернализации, центральное место занимает репрессор FLOWERING LOCUS C (FLC). Ген FRLGLDA (FRL) усиливает экспрессию FLC, и взаимодействие сильных и слабых аллелей FLC и FRL во многом объясняет различную потребность растений арабидопсиса в индукции холодом. У однолетних и двулетних жизненных форм Brassica различия по времени зацветания также связаны с FLC, однако роль FRL в процессе вернализации у этих растений исследована недостаточно. В отличие от арабидопсиса, в геномах Brassica A и C и, предположительно, B ген FRL представлен двумя экспрессируемыми локусами FRL.a и FRL.b, каждый из которых обнаруживает геном-специфичный полиморфизм. Последовательности FRL.a и FRL.b из диплоидных видов B. rapa (геном A) и B. oleracea (геном C) сохраняются (96—99% сходства) в субгеномах A и C тетраплоидных видов B. carinata (геном BC), B. juncea (геном AB) и B. napus (геном AC). При филогенетическом анализе FRLв роде Brassica отчетливо различаются последовательности FRL, принадлежащие к линиям A/C и B, а в семействе Brassicaceae выделяются два кластера FRL, соответствующие линиям I (включая род Arabidopsis) и II (включая род Brassica). Обсуждаются гипотезы, связывающие появление двух локусов FRL с палеоплоидией и последующей реорганизацией геномов в процессе эволюции Brassicaceae.
Ключевые слова: Brassica - FRLGLDA - вернализация - дупликация гена - переход к цветению - эволюция
DOI: 10.7868/S0015330314030038
ВВЕДЕНИЕ
Генетические исследования развития уделяют первостепенное внимание переходу к цветению как важнейшему событию в жизни растений. В умеренных широтах важную роль в этом переходе играет продолжительное воздействие низкими положительными температурами (вернализация), и реакция на холодовое воздействие во многом определяет стратегию адаптации растений. В опытах с модельными формами Arabidopsis thaliana (L.) Heinh. взаимодействие сильных и слабых аллелей генов FLOWERING LOCUS C (FLC) и FRLGLDA (FRL) во многих случаях объясняет потребность растений в холодовой индукции перехода к цветению. Эта зависимость усложняется при проведении исследований в различных экологических условиях: в этом случае регуляторный эффект FRL не всегда заметен на
Сокращения: а.о. — аминокислотный остаток; п.н. — пара нуклеотидов; FRL - FRLGLDA; FLC - FLOWERLNG LOCUS C; QTL — локус количественного признака (от quantitative trait locus).
Адрес для корреспонденции: Фадина Оксана Алексеевна. 127550 Москва, Тимирязевская ул., 42. ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Электронная почта: fadinaokcaha@ gmail.com
фоне других генов фотопериодического пути и пути вернализации (см. обзоры [1-5]).
Жизненные формы культурных Brassica L. -это яровые и озимые однолетние и двулетние растения, которые происходят из субтропиков и умеренных широт и сильно различаются по времени зацветания. Как и у A. thaliana, эти различия связаны с FLC (см. [6, 7]), однако роль FRI в процессе вернализации у этих растений исследована недостаточно.
В отличие отA. thaliana, в геномах A и C Brassica ген FRI представлен двумя локусами — FRI.a и FRI.b [8-10], каждый из которых обнаруживает геном-специфичный полиморфизм. Ген FRI в геноме B до недавнего времени не был изучен [11].
В геномах A и C Brassica все последовательности гена FRI содержат консервативный участок, который соответствует в белке FRIGIDA центральному домену Frigida, характерному для суперсемейства белков FRIGIDA и FRIGIDA-LIKE 1 [12]. Ранее мы показали [10], что присутствие специфичной 37-аминокислотной последовательности в N-концевой части продуктов трансляции генов FRI.a и FRI.b Brassica позволяет отнести их к классу I FRIGIDA, а не к FRIGIDA-LIKE. Белок FRIGIDA A. thaliana содержит
coiled-coil домены в двух положениях, в N- и C-концевых областях. В случае Brassica образование coiled-coil домена на C-концевом участке белка у всех белков FRIGIDA.a и FRIGIDA.b предсказано с высокой вероятностью (0.90), однако биспи-ральная структура на N-концевой части белка наблюдается только у FRIGIDA.a B. oleracea и предсказывается с меньшей вероятностью (0.76), чем у белка-прототипа из A. thaliana (0.90). При сравнительном анализе аминокислотных последовательностей мы обнаружили характерные повторы: три повтора MEEARSIS у FRIGIDA.a и два повтора MEGEARSIS и MQGEARSIS у FRIGIDA.b, которые сходны с единственным повтором MEEKARSLS у FRIGIDA A. thaliana. Эти повторы, критичные для взаимодействия FLOWERING LOCUS C - FRIGIDA [8, 12], перекрываются с доменом Frígida и coiled-coil доменом в C-конце-вом участке белка [10].
Оба локуса FRI экспрессируются [8-10]. Определенные доказательства связи этого гена с переходом растений Brassica к цветению получены только для локуса FRI.a: в случае B. napus показана связь FRI.a с QTL для времени перехода к цветению [8], а в случае B. oleracea ген FRI.a компле-ментировал неактивный ген fri у мутантов A. thaliana [9]. Хотя экспрессия генов FLC и FRI коррелировала у B. napus, при картировании двух генов их связь не была значимой [6]. Функция локуса FRI.b пока неизвестна.
В настоящей работе мы сопоставили последовательности гена FRI в геномах A, B и C у шести диплоидных и аллотетраплоидных видов Brassica.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Мы исследовали диплоидные и тетраплоидные виды Brassica L. с геномами A, B и C: Brassica rapa L. (геном A), B. nigra (L.) W.D.J. Koch (геном B), B. oleracea L. (геном C), B. juncea (L.) Czern. (геном AB), B. napus L. (геном AC) и B. carinata A. Braun (геном BC). Семена растений были получены из коллекций Centre for Genetic Resources (Вагенинген, Нидерланды). А.М. Артемьева (ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, С.-Петербург) любезно предоставила нам семена форм Brassica, контрастных по времени зацветания. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге два дня и затем высаживали в почву. Растения выращивали при комнатной температуре при постоянном освещении под лампами OSRAM Circolux EL (24 Вт).
Молекулярные методы исследования. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев с помощью набора AxyPrep™ Multisource Genomic DNA Miniprep Kit ("Axygen Biosciences", США). Концентрацию выделенной ДНК измеряли при 260 нм на NanoPhotometer P 300 ("IMPLEN", Германия).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе DNA Engine PTC 200 ("BioRad", США). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала: 10x PCR буфер, 2 мМ MgCl2, 100 нг геномной ДНК, 0.2 мМ dNTP, по 1 мМ прямого и обратного праймеров и 1 U Taq-ДНК полимеразы ("Fermentas", Германия) для амплификации FRI.a и 2.5 U Pfu-полимеразы ("Fermentas") для амплификации FRI.b. Для амплификации полноразмерных последовательностей локусов гена FRI ПЦР проводили по следующей программе: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 60°C, 3 мин 30 с при 72°C; один цикл 15 мин при 72°C. Для амплификации специфичных фрагментов гена FRI использовали следующую программу: 1 цикл 30 с при 94°С; 30 циклов 30 с при 58°C, 2 мин при 72°C; один цикл 15 мин при 72°C. Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 0.8% агарозном геле при напряжении электрического поля 6-7 В/см. Гели фотографировали в УФ-свете (длина волны 312 нм) с помощью цифровой системы Biotest ("Биоком", Россия).
Праймеры для ПЦР подбирали вручную на основании множественного выравнивания последовательностей FRI и оптимизировали с помощью программы Oligonucleotide Properties Calculator (http: //www.basic .northwestern.edu/biotools) по следующим параметрам: температура отжига, GC состав, возможное образование шпилек и ди-меров. Оптимизированные праймеры были проверены на возможность неспецифичного отжига с помощью программы BLAST (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov). Все праймеры синтезированы компанией "Синтол" (Россия) (www.syntol.ru).
Очищенные фрагменты ДНК клонировали с помощью наборов PCR Cloning Kit InsTAclone™ с использованием вектора pTZ57R/T и CloneJet PCR Cloning Kit с использованием вектора pJet ("Fermentas"). Для трансформации клеток лабораторного штамма Escherichia coli JM109 использовали набор TransformAid ("Fermentas"). Трансформированные клетки высевали на селективную среду с ампициллином, X-gal и IPTG для проведения бело-голубой селекции трансформантов. Для выделения плазмидной ДНК использовали набор AxyPrep Plasmid Miniprep Kit ('Axygen Biosciences"), согласно протоколу фирмы-производителя. Клонированные фрагменты ДНК секвенировали на автоматическом анализаторе ABI 3130 ("Applied Biosystems", США), и хроматограммы нуклеотидных последовательностей были визуально изучены с использованием Chromas Lite 2.0 (www.technelysi-um.com.au/chromas_lite.html); отредактированные вручную последовательности депонировали в Ген-банке NCBI под номерами JN015481, JN015482, JN882592—JN882595, JN989363, KC937068, KF896287-KF896289.
BrAC.FRIaFRIbR
BrA.FR/aR
(а)
BrAC.FRIaF BrB.FRIaR BrC.FRIaR
— ^_ —
1 907 1203 1375 1468 2178
ATG
715
II
III
(б)
693
BrFRIF 1173
5'
BrA.FRIbF BrC.FRIbF
BrB.FRIaF
£*~1203_1375 1456
BrFRIR
Л
TAG
2293
3'
(в)
1
5' —1= ATG
I 1198 II
BrAC.FRIaFRIbR
907 1203 1296 1391
III 2138
BrAC.FRIbR
2069
715
II
III
TAA
2084
N-концевой регион Frigida домен
C-концевой регион
Рис. 1. Положение праймеров для амплификации гена FRIиз геномов Brassica А, В и С.
а — FRIa из геномов A и C; б — FRIa и FRIb из генома B; в — FRIb — из геномов A и C. 1 — положение старт-кодона, 2178 и 2069 — положение стоп-кодона. Интроны обозначены сплошной черной линией. Черными прямоугольниками и римскими цифрами обозначены экзоны. Арабскими цифрами и стрелками показано расположение и направление праймеров. Горизонтальной скобкой обозначено положение центрального консервативного домена Frigida. См. также табл. 1.
I
Методы биоинформатики. Последова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.