== РАДИАЦИОННАЯ ГЕНЕТИКА =
УДК [57+61]:539.1.047:575.116
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА
© 2013 г. Л. Е. Сальникова, А. Г. Чумаченко, О. Б. Белопольская, А. В. Рубанович*
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
Для однородной выборки доноров (99 человек) изучалась сопряженность частоты у-индуцирован-ных (1 Гр in vitro) аберраций хромосом с полиморфизмом 45 кандидатных генов репарации, деток-сикации и оксидативного стресса (всего 53 сайта). Показана сопряженность уровней аберраций хромосомного типа с носительством минорных аллелей полиморфных сайтов генов OGG1 Ser326Cys, ABCB1 Ile1145= и NQO1 Pro187Ser (р = 0.0002). Продемонстрировано, что все выявленные генетические ассоциации в прогностическом отношении уступают корреляционным связям между частотами спонтанных и у-индуцированных аберраций (p = 1.0 х 10 ). Совместное использование генетических и цитогенетических предикторов позволяет довести коэффициент множественной корреляции до уровня R = 0.58 (p = 3.1 х 10-8) и тем самым объяснить более 30% популя-ционной изменчивости радиочувствительности хромосом.
Генетический полиморфизм, гены репарации ДНК, ассоциативные исследования, радиочувствительность хромосом, воздействие у-излучения in vitro, хромосомные аберрации.
DOI: 10.7868/S0869803113030120
Настоящая публикация подытоживает результаты длительного эксперимента, направленного на систематический поиск генотипических ассоциаций радиочувствительности хромосом человека. Эти исследования проводились с использованием банка ДНК молодых здоровых добровольцев, для которых ранее был проведен тщательный цитогенетический анализ спонтанных и у-инду-цированных (1 Гр in vitro) аберраций хромосом лимфоцитов периферической крови. Исследования имели рекуррентный характер: при обнаружении литературных данных о влиянии широко распространенной однонуклеотидной замены (SNP) на реализацию повреждений ДНК соответствующий полиморфизм проверялся на наличие сопряженности с частотой и спектром хромосомных аберраций. В предыдущих публикациях мы приводили результаты подобных исследований для локусов, связанных с детоксикацией ксенобиотиков, оксидативным ответом [1—3] и эксци-зионной репарацией ДНК [4], причем основные эффекты были зарегистрированы относительно спонтанных аберраций как в контрольной группе добровольцев, так и у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС. В других ассоциативных исследованиях, выполненных на экспонированных группах людей, в ряде случаев было показано, что минорные функциональные аллели некоторых генов детоксикации ксенобиотиков и эксцизион-
* Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ул. Губкина. 3, ИОГен РАН; тел.: (499) 132-89-58; e-mail: rubanovich@ vigg.ru.
ной репарации могут не влиять на радиочувствительность при хроническом облучении [5], либо быть слабопенетрантными вариантами, ассоциированными с повышенной частотой хромосомных аберраций [6—8].
Данные о генетических ассоциациях при остром облучении также противоречивы и известны для сравнительно небольшого числа генов. Цель представленной работы — изучение ассоциации широкого спектра функциональных полиморфных вариантов генов, контролирующих метаболические пути детоксикации и репарации повреждений ДНК, с индивидуальной радиочувствительностью хромосом человека. Список генов-кандидатов был существенно расширен. Кроме часто изучаемых в связи с индивидуальным ответом на воздействие ионизирующих излучений генов детоксикации ксенобиотиков, эксцизионной репарации оснований и эксцизионной репарации нуклеотидов, данный список был, в частности, пополнен 13 генами репарации двунитевых разрывов ДНК. Основное внимание было уделено соотношению прогностических возможностей генетических и цитогенетических предикторов радиочувствительности хромосом при остром облучении. Было показано, что все выявленные ассоциации "8МР — радиочувствительность хромосом" в прогностическом отношении уступают корреляционным связям между уровнями спонтанных и у-индуцирован-ных аберраций.
М50 Т/С С/С Т/С Т/Т Т/Т Т/Т С/С Т/С Т/С Т/С С/С
377 п.н.
236 п.н. 179 п.н.
щ
АВСВ1 (МБЯЛ) Т3435С Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов гена АВСВ1 (Т3435С).
МАТЕРИЛЫ И МЕТОДИКА
Для изучения корреляций частот спонтанных и индуцированных аберраций хромосом с полиморфизмом ДНК были взяты образцы периферической крови у 115 молодых (20—25 лет) здоровых мужчин — курсантов Военно-технического университета (г. Балашиха). Исследования были одобрены Этическими комиссиями ИОГен РАН и Военно-технического университета. Цитогенети-ческий анализ удалось провести для 96 доноров при учете спонтанных аберраций и для 99 доноров при анализе индуцированных аберраций. Каждый образец цельной крови для цитогенети-ческого обследования разливали в две пробирки: первая за 1 ч до культивирования подвергалась воздействию у-излучения в дозе 1 Гр (60Со, мощность дозы 1.37 Гр/мин), вторую использовали для анализа спонтанных аберраций хромосом.
Приготовление препаратов с метафазными клетками для учета аберраций хромосом осуществлялось по стандартной методике [9]. Анализировали от 500 (в случае у-индуцированных аберраций) до 1000 (в случае спонтанных аберраций) метафаз первого митоза на человека. Производился дифференциальный учет аберраций хромосомного (дицентрические и кольцевые хромосомы, ацентрики, атипичные моноцентрики) и хроматидного (одиночные и изохроматидные фрагменты, обмены) типов. Оценки частот аберраций приведены в формате р ± БЕ, где р — среднее число аберраций на просмотренную клетку, БЕ — ошибка среднего, вычисленная по внутри-групповой дисперсии частот.
Выделение ДНК было подробно описано ранее [9]. Генотипирование осуществлялось с использованием аллель-специфической тетрапрай-
мерной ПЦР. Метод позволяет в одной пробирке амплифицировать фрагменты ДНК, соответствующие альтернативным аллелям [10]. Продукты амплификации разделяются электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием (рис. 1). Список сайтов изученных локусов с указанием ^-идентификаторов и функциональности полиморфизма приведен в табл. 1. В общей сложности осуществлено генотипирова-ние по 45 генам (53 полиморфным сайтам).
Анализ сопряженности полиморфных вариантов с частотами аберраций хромосом проводился методами многомерного регрессионного анализа, реализованными в компьютерной программе "8ТАТ18Т1СА 6.0". При вычислении регрессий "аберрации ~ генотипы" использовалась стандартная перекодировка генотипов в соответствии с числом минорных аллелей: 0 — преобладающие по частоте гомомозиготы, 1 — гетерозиготы, 2 — гомозиготы по минорному аллелю (аллельный вариант, присутствующий в группе исследования с меньшей частотой). Для поиска значимых генетических ассоциаций был использован алгоритм с пошаговым включением предикторов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределения аллельных частот для всех сайтов из табл. 1 соответствовали равновесию Хар-ди—Вайнберга и не отличались от обследованных ранее групп жителей Центрального региона России. Средняя частота спонтанных аберраций составила 0.0079 ± 0.0006; из них аберраций хромосомного типа 0.0021 ± 0.0003. Средняя частота у-индуцированных аберраций была равна 0.123 ± ± 0.003; из них 0.110 ± 0.002 — аберрации хромосомного типа, в том числе 0.059 ± 0.001 — радиа-
Таблица 1. Характеристика полиморфных сайтов изученных генов
Ген Полиморфизм* Инд. номер Функция**
Репарация двунитевых разрывов ДНК (контроль клеточного цикла, гомологичная рекомбинация ДНК, негомо-
логичное соединение (non-homologous end joining — NHEJ) двунитевых разрывов ДНК)
XRCC2 563G>A rs3218536 Arg188His
XRCC2 121+5647G>C rs3218499 Intronic
XRCC3 722C>T rs861539 Thr241Met
XRCC4 316-17944A>G rs10040363 Intronic
Ku-70 (XRCC6) 88+57G>C rs2267437 nearGene-5
Ku-80 (XRCC5) *841G>A rs2440 UTR-3
BRCA2 3396A>C rs1801406 Lys1132=
Lig4 26C>T rs1805388 Thr9Ile
Artemis (DCLRE1C) 812-2695C>T rs12572872 Intronic
RAD51 -98G>C (G135C) rs1801320 UTR-5
RAD51 -61G>T (G172T) rs1801321 UTR-5
ATM 5557G>A rs1801516 Asp1853Asn
ATR 632T>C (С340Т) rs2227928 Met211Thr
NBN(NIBRIN) 553G>C rs1805794 Glu185Gln
Tp53 215C>G rs1042522 Pro72Arg
Эксцизионная репарация нуклеотидов
ERCC1 -188-96G>T rs2298881 Intronic
ERCC1 354T>C rs11615 Asn118=
XPA -4A>G (G23A) rs1800975 UTR-5
XPB (ERCC3) 1343-2708A>G rs4150441 Intronic
XPC 1496C>T rs2228000 Ala499Val
XPD (ERCC2) 862G>A rs1799793 Asp312Asn
XPD (ERCC2) 2251A>C rs13181 Lys751Gln
XPF (ERCC4) -9-21T>A rs1799797 nearGene-5
XPG (ERCC5) 3310G>C rs17655 Asp1104His
RAD23B 746C>T rs1805329 Ala249Val
Эксцизионная репарация оснований
LIG3 *50C>T rs1052536 UTR-3
POLB 62-89C>T rs3136717 Intronic
XRCC1 580C>T rs1799782 Arg194Trp
PARP1 (ADPRT) 2285T>C rs1136410 Val762Ala
XRCC1 1196A>G rs25487 Gln399Arg
APEX1 444T>G rs1130409 Asp148Glu
OGG1 977C>G rs1052133 Ser 326 Cys
Детоксикация ксенобиотиков, фаза 1
PON1 575A>G rs662 Gln192Arg
CYP1A1 -27+606T>G rs2606345 Intronic
*947+242T>C
CYP1A1 (T3801C) rs4646903 nearGene-3
CYP1A1 1384A>G (A4889G) rs1048943 Ile462Val
CYP1B1 1294C>C rs1056836 Leu432=
506-1G>A
CYP2D6 (G1846A) rs3892097 splice-3
Детоксикация ксенобиотиков, фаза 2
GSTM1 Ins/Del — Null-allele
GSTT1 Ins/Del - Null-allele
EPHX1 337T>C rs1051740 Tyr113His
EPHX1 416A>G rs2234922 Arg139His
GSTM3 670G>A rs7483 Val224Ile
GSTP1 313A>G rs1695 Ile105Val
NQO1 559C>T rs1800566 Pro187Ser
COMT 472G>A (G1947A) rs4680 Val158Met
NAT2 590G>A rs1799930 Arg197Glu
262 САЛЬНИКОВА и др.
Таблица 1. Окончание
Ген Полиморфизм* Инд. номер Функция**
ABC-транспортер
ABCB1 (MDR1) 3435T>C rs1045642 Ile1145=
Оксидативный стресс
SOD2 47T>C rs4880 Val16Ala
CAT —89A>T (T21A) rs7943316 UTR-5
-484-110C>T
GCLC (C129T) rs17883901 nearGene-5
Клеточный цикл
CCND1 723G>A rs9344 Pro241=
Метилирование
MTHFR 665C>T (C677T) rs1801133 Ala222Val
Примечания. *Номенклатура 8КР приводится с определением позиции по кДНК, в скобках могут быть указаны традиционно встречающиеся в литературе названия; **Arg197Glu — несинонимичная замена; Lys1132= — синонимич
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.