ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 5, с. 663-673
ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ
УДК (575.13+575.224+581.143.6+576.356+581.331.2):633.174
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ И ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАЦИИ МУЖСКОЙ СТЕРИЛЬНОСТИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ СТРЕПТОМИЦИНОМ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ СОРГО
© 2008 г. Л. А. Эльконин, М. И. Цветова
Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии,
Саратов 410010; e-mail: elkonin@mail.saratov.ru Поступила в редакцию 02.03.2007 г.
Показано, что обработка каллусных культур сорго раствором стрептомицина (500-1000 мг/л) ведет к высокой частоте регенерации растений с полной или частичной мужской стерильностью (МС) (до 100% от числа зеленых регенерантов). Индуцированная мутация МС (ms-str) сохранялась в F1 и BC1 при скрещивании мутантов с исходной линией, однако проявляла генетическую нестабильность: во многих семьях возникали полустерильные и фертильные ревертанты, в потомстве которых вновь выщеплялись полустерильные и стерильные формы. Путем отбора и самоопыления полустерильных растений ms-str поддерживалась в течение восьми поколений. В тестерных скрещиваниях стерильных растений, выщеплявшихся в потомстве фертильных и полустерильных ревертантов, мутация наследовалась как ядерная рецессивная; в тест-кроссе на перенос ms-str через пыльцу гибридами с восстановленной мужской фертильностью мутация проявлялась лишь в единичных случаях. У мужски-стерильных растений с мутацией ms-str были выявлены также рецессивные ядерные мутации низкорослости (dwarfness) и отсутствия воскового налета на стебле и листьях (bloomless). Цитологический анализ стерильных растений выявил множество нарушений на разных стадиях развития пыльцы и в клетках тапетума: цитомиксис, нарушение конъюгации хромосом, нарушение цитокинеза во II делении мейоза, нераспадение тетрад, нарушение формирования оболочки микроспор, образование микроспор с 2-4 ядрами, образование микроядер и крупных вакуолей в клетках тапетума. Обсуждаются возможность переноса индуцированной цитоплазматической мутации МС в ядерный геном и природа высокой генетической нестабильности.
Мутации мужской стерильности являются исключительно удобными фенотипическими маркерами, позволяющими выявлять гены, контролирующие развитие мужской генеративной сферы растений, а также осуществлять мониторинг мутационных процессов в различных генетических системах клетки. Хорошо известно, что формирование фертильных пыльцевых зерен контролируется тесно взаимодействующими между собой многочисленными ядерными и цитоплазматически-ми генами, мутации в которых ведут к возникновению генной (ГМС) или цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) [1].
Исследование мутантов с ГМС, полученных за последние годы главным образом с помощью методов генной инженерии, позволило идентифицировать ряд ядерных генов, контролирующих развитие пыльников и пыльцы [2-5]. Цитоплазмати-ческие гены, участвующие в данном процессе, у большинства видов растений изучены в меньшей степени. Анализ линий с цитоплазматической мужской стерильностью, полученных в результате отдаленной гибридизации, показал, что ЦМС возникает в результате экспрессии специфических митохондриальных генов, кодирующих белки, препятствующие нормальному функциониро-
ванию митохондрий [6, 7]. Экспрессия таких митохондриальных ЦМС-индуцирующих генов наблюдается только при их взаимодействии с генетически отдаленным ядерным геномом, или в аллоплазматических гибридных комбинациях. При наличии "собственного" генома, т.е. в эуплазматических линиях, а также в гибридах со специфическими линиями-восстановителями фертильности, функционирование этих генов ин-гибируется ядерными генами-восстановителями, которые подавляют экспрессию митохондриальных ЦМС-индуцирующих генов в большинстве случаев на пост-транскрипционном уровне. Возникновение таких генов-восстановителей, обладающих высокой специфичностью и имеющих структурное сходство с генами иммунного ответа, как предполагают, является результатом "ответа" ядерного генома на цитоплазматическую мутацию, нарушающую внутриклеточный гомео-стаз [8].
Причины и механизмы возникновения ЦМС-индуцирующих генов слабо изучены. Предполагают, что они возникают в результате высокой рекомбинационной активности, свойственной ми-тохондриальному геному [7], однако экспериментальные доказательства данного явления отсут-
ствуют; факты индукции стабильных мутантов с ЦМС редки и, за исключением единичных случаев [9], слабо изучены. Вместе с тем более интенсивное исследование данной проблемы способствовало бы не только получению новых источников мужской стерильности для целей практической селекции, но и пониманию происхождения генетического разнообразия и эволюции цитоплазматиче-ских геномов растений.
Одним из эффективных методов получения мутантов с ЦМС может быть экспериментальный мутагенез с использованием веществ, известных своей способностью к индукции цитоплазма-тических мутаций: антибиотиков [10-13], акридиновых красителей [13, 14], источников свободных радикалов, вызывающих усиление окислительного стресса [15]. Известно также, что выращивание клеток в условиях культуры in vitro является мощным фактором дестабилизации митохондри-ального генома растений и может приводить к индукции мутаций мужской стерильности [16].
Используя подход, основанный на сочетании данных факторов, а именно путем обработки каллусных культур раствором стрептомицина, нами ранее были получены мутанты сорго с мужской стерильностью [17, 18]. В данной работе сообщаются результаты изучения наследования индуцированной мужской стерильности и цитологических механизмов ее возникновения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения мутантов с мужской стерильностью использовали каллусные линии, полученные от молодых метелок следующих линий и сортов зернового сорго (Sorghum bicolor (L.) Moench): Май-ло-10, Волжское-2, Раннее-7. Все эти формы несли гены-восстановители фертильности ЦМС типа А1, при этом Майло-10 и Раннее-7 несли также стерильную цитоплазму А1. Каллусы инкубировали в растворе стрептомицина (500 и 1000 мг/л) в течение 24 ч при 26°С в темноте без покачивания на шейке-ре. После промывки стерильной дистиллированной водой каллусы переносили вначале на среду для пассирования и затем на среду для регенерации [19]. Зеленые и пестролистные растения-регенеранты высаживали в вегетационные сосуды и выращивали в теплице. Потомство регенерантов выращивали в полевых условиях в 3-5-м рядах.
Фертильность регенерантов и их потомства оценивали визуально по наличию фертильных пыльников и по завязываемости семян на метелках, изолированных до начала цветения, при этом выделяли следующие классы: стерильные (с) (0% завязываемости); полустерильные (пс) (завязыва-емость менее 50%, обычно - несколько веточек с зерном, расположенных секторами, чаще всего в нижней части метелки); фертильные (ф) (завязы-
ваемость более 50%). Для скрещиваний использовали растения, у которых отсутствовали фертильные пыльники и у которых через 3 дня после окончания цветения нижнего яруса сохранялись "свежие" рыльца на всей метелке. Растения с полной мужской стерильностью опыляли пыльцой исходной линии и линии-закрепителя стерильности для известных типов стерильных цитоплазм сорго (А1, А2, А3, А4, 9Е) - Ефремовское-2В.
Стерильные растения из поколения были подвергнуты цитологическому исследованию. Соцветия фиксировали в ацетоалкоголе (1 : 3), промывали и хранили в 75%-ном спирте. Для окраски использовали ацетокармин (2%-ный) после предварительного протравливания материала в 4%-ном растворе железо-аммонийных квасцов в течение 25 мин при температуре 45-50°. Для приготовления давленых препаратов из пыльников сорго использовали смесь 45%-ной уксусной кислоты и 70%-ного хлоралгидрата (1 : 1), подкрашенную ацетокармином.
Статистический анализ расщеплений в популяциях Б2 и ВС1 проводили с использованием метода х2. Значимость различия высоты фертильных, полустерильных и стерильных растений, вы-щеплявшихся в популяциях Б2, оценивали с помощью ¿-критерия Стьюдента [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика растений-регенерантов
Растения, регенерированные из обработанных стрептомицином каллусов, в большинстве были альбиносами или пестролистными, причем количество хлорофилл-дефектных регенерантов значительно возрастало при увеличении концентрации стрептомицина (табл. 1). Такой результат следовало ожидать, учитывая известные данные о способности стрептомицина к индукции пла-стомных мутаций и блокированию работы хлоро-пластов [21-23]. При концентрации 1000 мг/л все или большинство регенерантов были хлорофилл-дефектными. У пестролистных регенерантов хлорофилл-дефектность постепенно элиминировалась, и происходило формирование нормальных зеленых листьев.
Выжившие зеленые и пестролистные регене-ранты характеризовались полной или частичной мужской стерильностью, причем частота возникновения стерильных форм у некоторых образцов достигала 100% от числа выживших регенерантов (табл. 1). Растения с полной или частичной мужской стерильностью были регенерированы у всех испытанных образцов. Концентрация стрептомицина оказала существенное влияние на количественное и качественное проявление мужской стерильности. Так, у Майло-10 для получения
Таблица 1. Мужская фертильность регенерантов различных линий сорго, регенерированных из каллусных культур, обработанных раствором стрептомицина
Линия Концентрация стрептомицина, мг/л Количество регенерантов
# всего*, шт. зеленых, % хлорофилл-дефектных, % * ф пс с
Майло-10 0 115 96 4 10 0 0
500 59 25 75 0 0 4
1000 26 0 100 - - -
Волжское-2 0 204 92 8 10 0 0
500 180 23 77 2 9 2
1000 48 0 100 0 0 6
Раннее-7 0 162 100 0 4 0 0
500 414 14 86 0 2 2
1000 394 5 95 - - -
Примечание. # число регенерированных побегов; * процент альбиносных и пестролистных побегов; ф - фертильные, пс - полустерильные, с - стерильные растения.
полностью мужски-стерильных регенерантов эффективной оказалась концентрация 500 мг/л, тогда как у Волжского-2 в этом варианте были получены в основном полустерильные и фертильные формы, тогда как при увеличении концентрации до 1000 мг/л возникали полностью му
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.