ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 6, с. 763-775
= ОБЗОРЫ
УДК 581.1
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ СТРАТЕГИИ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ТОМАТА К ГРИБНЫМ И БАКТЕРИАЛЬНЫМ ПАТОГЕНАМ © 2013 г. М. Р. Халилуев*, Г. В. Шпаковский**
*Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва **Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва Поступила в редакцию 24.01.2013 г.
Представлена классификация и проведен подробный обзор известных в настоящее время эффективных стратегий повышения устойчивости растений томата (Solanum lycopersicum L., syn. Lycopersi-con esculentum Mill.) к инфекционным болезням грибной и бактериальной этиологии с помощью генно-инженерных подходов. Приведены современные данные о механизмах защитного действия гетерологичных генов на повышение устойчивости трансгенных растений томата к грибным и бактериальным патогенам.
Ключевые слова: Solanum lycopersicum (Lycopersicon esculentum) — генетическая трансформация — устойчивость — фитопатогены — PR-белки — антимикробные пептиды
DOI: 10.7868/S0015330313050084
ВВЕДЕНИЕ
Томат (Solanum lycopersicum L., syn. Lycopersicon esculentum Mill.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продукции овощеводства, как по своему значению, так и по объему производства. По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (FAO), мировой валовой сбор товарной продукции томата в 2010 г. составил более 145.8 млн. т, из которых на долю России приходилось около 1.4% (2 млн. т) при возделывании на площади 115.2 тыс. га [1]. Высокий спрос на томат обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения ряда хозяйственно ценных признаков.
Сокращения: АМП — антимикробные пептиды; БИПГ — белковые ингибиторы полигалактуроназ; СВЧ — реакция сверхчувствительности; СПУ — системная приобретенная устойчивость; 35SCaMV — конститутивный промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты; KLP — семейство ноттиноподобных пептидов; PR-белки — белки, синтезируемые в растительной клетке при атаке патогеном (от patho-genesis-related proteins); RIP — семейство рибосом-инакти-вирующих белков.
Адрес для корреспонденции: Шпаковский Георгий Вячеславович. 117997 Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10. Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, лаборатория механизмов генной экспрессии. Факс: +7(495) 335-71-03; электронная почта: gvs@ibch.ru
Средняя урожайность томата в России по-прежнему остается низкой и за период 2000—2010 гг. составляла 14.9 т/га [1]. Одной из главных причин, лимитирующих высокую продуктивность томата, является существенный ущерб, наносимый болезнями. У томата насчитывается около 40 наиболее распространенных инфекционных болезней, большая часть которых имеет грибную и бактериальную этиологию. В связи с этим, устойчивость к биотическим стрессам — одно из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томатов.
Несмотря на достигнутые успехи классической селекции в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости, а также устойчивости к наиболее опасным болезням до сих пор не решена [2]. Причинами тому служат генетическая сложность признака, постоянные эволюционные процессы, происходящие в системе "хозяин—патоген", а также возникновение высоко устойчивых биотипов патогенов на фоне применения повышенных объемов химических средств защиты [3].
В последние десятилетия для повышения устойчивости растений (в том числе, томата) к биотическим стрессам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в установлении молекулярной природы защитных механизмов,
обеспечивший возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Применение трансгенных форм растений, устойчивых к биопатогенам, позволяет существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность растений. В представленном обзоре обобщены и представлены с описанием механизма их действия различные генно-инженерные стратегии, которые в настоящее время успешно применяются для повышения устойчивости растений томата к болезням, вызываемым грибными и бактериальными патогенами.
ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ
РАСТИТЕЛЬНЫЕ PR-БЕЛКИ И АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ (АМП)
Экспрессия генов гетерологичных растительных PR-белков (белков, синтезируемых в растительной клетке при атаке патогеном) и антимикробных пептидов (АМП) является наиболее часто используемой генно-инженерной стратегией повышения устойчивости томата к болезням грибной и бактериальной природы (табл. 1). Согласно современной классификации, по сходству аминокислотных последовательностей, биохимическим характеристикам, биологической активности и клеточной локализации различают 17 семейств PR-белков и 9 семейств АМП [28—31]. Все защитные белки и пептиды характеризуются сравнительно небольшим размером, являются положительно заряженными, содержат значительное количество остатков цистеина, стабилизирующих третичную структуру за счет образования дисульфидных связей, число которых в зависимости от вида составляет от 2 до 8 [28, 30]. В результате многочисленных исследований in vitro было установлено, что многие из защитных PR-белков и АМП уже в микромолярных концентрациях обладают высокой антибактериальной и/или антифунгальной активностью, сравнимой с применением химических препаратов. Некоторые из них не оказывают токсического воздействия на клетки животных и человека, что является важным аспектом в отношении биобезопасности трансгенных растений [29, 31].
Для создания трансгенных растений томата с повышенной устойчивостью к патогенным микроорганизмам одними из первых были использованы растительные гены гидролитических ферментов — Р-1,3-глюканаз и хитиназ, выделенные, соответственно, в PR-2 и PR-3 семейства защитных белков. Мишенями для Р-1,3-глюканазы и хитиназы являются, соответственно, Р-1,3-глю-кан и хитин, являющиеся основными компонен-
тами клеточной стенки большинства грибных патогенов. Защитная функция гидролитических ферментов, главным образом, связана с их способностью разрушать клеточную стенку и, тем самым, тормозить дальнейший рост и распространение гифов по растительным тканям. Хитиназа может действовать также как лизоцим, гидролизуя пептидоглюканы клеточных стенок бактерий [32].
В исследовании Tabaeizadeh с соавт. [7] методом агробактериальной трансформации в геном культурного томата был введен ген кислой эндо-хитиназы (pcht28) из дикорастущего вида Solanum chilense (Dunal) Reiche. Растения, полученные в результате самоопыления первичных трансформантов, отличались повышенной устойчивостью к расам 1 и 2 Verticillium dahliae. Оценка в условиях защищенного грунта трансгенных растений поколения Т2 на устойчивость к расе 2 V. dahliae показала, что степень проявления симптомов болезни у гомозиготных линий была существенно меньше по сравнению с нетрансформированным контролем.
Экспрессия гена ß-1,3-глюканазы кукурузы (M-GLU) у двух тестируемых трансгенных линий томата способствовала снижению симптомов развития альтернариоза на 7, 14 и 21 сутки после инокуляции растений суспензией конидий грибного патогена Alternaria solani [6].
Повышение устойчивости томата к возбудителю фузариозного увядания было достигнуто за счет конститутивной экспрессии генов хитиназы риса (chi11) и эндохитиназы пшеницы (chi194) [8, 9]. В первом случае две трансгенные линии томата поколения Т1 характеризовались меньшей частотой инфицированных растений (соответственно 11 и 60%) по сравнению с нетрансформи-рованным контролем (80%). Экспрессия гена эндохитиназы пшеницы под контролем промотора гена убиквитина кукурузы существенно повышала устойчивость к фузариозному увяданию у двух трансгенных линий томата (поражаемость Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, соответственно, на уровне 2 и 3 баллов) по сравнению с восприимчивым диким типом (8 баллов).
Рядом исследователей [10—12] продемонстрировано повышение устойчивости томата к фитопа-тогенам за счет экспрессии растительных хитин-связывающих белков, выделенных в PR-4 семейство, и гевеиноподобных АМП. Отличительной особенностью обеих этих групп защитных пептидов является высокое сродство к полисахаридной цепи хитина, представляющего собой ß-1,4-подоб-ный биополимер N-ацетилглюкозамина. Данное сродство обусловлено наличием N-терминального хитин-связывающего домена, имеющего сходство с аминокислотной последовательностью гевеина — белка, выделенного из млечного сока Hevea brasil-iensis Müll. Arg. [33]. Антигрибная активность бел-
Таблица 1. Повышение устойчивости томата к грибным и бактериальным патогенам за счет экспрессии генов растительных РЯ-белков и АМП
Семейство Продукт Ген Источник гена Фенотип (устойчивость) Источник
PR-1 основный РЯ-бе-лок 1 CABPRl Capsicum annum L. повышенная устойчивость к Phy-tophthora capsici; очень слабая устойчивость к Pseudomonas syringae pv. tomato [4]
PR-2 PR-3 Р -1,3-глюканазы хитиназы Glu-I,II Chi-I,II Nicotiana tabacum L. повышенная устойчивость к Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici при одновременной экспрессии двух генов [5]
PR-2 RIP KLP Р-1,3-глюканаза рибосом-инакти-вирующий белок М]"-АМР1 M-GLU I-RIP Mj-AMPl Zea mays L. Iris hollandica var. Professor Blaauw Hort. Mirabilis jalapa L. трансгенные растения томата, экс-прессирующие гены M-GLU и M-AMP1, отличались повышенной устойчивостью к Alternaria solani [6]
PR-3 эндохитиназа pcht28 Solanum chilense (Dunal) Reiche повышенная устойчивость к расам 1 и 2 Verticillium dahliae [7]
PR-3 хитиназа chill Oryza sativa L. повышенная устойчивость к Fusari-um oxysporum f. sp. lycopersici [8]
PR-3
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.