ГЕНЕТИКА, 2014, том 50, № 6, с. 645-651
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 579.873.1:577.181.4
ГЕНЫ БИОСИНТЕЗА БУТЕНОЛИД-ПОДОБНЫХ СИГНАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ У Streptomyces ghanaensis, ИХ РОЛЬ В ПРОДУКЦИИ МОЕНОМИЦИНОВ
© 2014 г. Г. В. Мутенко1, Р. П. Макитринский1, О. В. Цыпик1, С. Уокер2,
Б. О. Осташ1, В. А. Федоренко1
1Львовский национальный университет им. Ивана Франко, кафедра генетики и биотехнологии, Львов 79005, Украина e-mail: bohdanostash@gmail.com; v_fedorenko@franko.lviv.ua 2Гарвардская медицинская школа, Отдел микробиологии и иммунобиологии, Бостон, МА 02115 США
e-mail: Suzanne_walker@hms.harvard.edu Поступила в редакцию 05.11.2013 г.
В данной работе описан ряд генов синтеза бутенолид-подобных низкомолекулярных сигнальных соединений (НСС) штамма АТСС14672 и изучено значение некоторых из них для продукции мое-номицинов (Мм). В геноме АТСС14672 обнаружены структурные и регуляторные гены продукции НСС авенолидного и у-бутиролактонного рядов. Введение дополнительных копий генов ssfg_07848 и ssfg_07725, контролирующих биосинтез этих НСС, не влияло на уровень продукции Мм штаммом АТСС14672. НСС АТСС14672 не способны восстановить споруляцию мутанта S. griseus IFO13350 с нарушенным синтезом А-фактора. Гетерологичный штамм S. lividans 1326, несущий гены синтеза Мм в составе космиды moeno38-5, продуцирует Мм. В то же время его мутант М707 moeno38-5+ с делецией гена у-бутиролактон-синтазы scbA не способен синтезировать Мм. Сделан вывод о том, что НСС необходимы для биосинтеза Мм, хотя естественный уровень синтеза НСС не ограничивает уровень продукции этих антибиотиков в клетках S. ghanaensis АТСС14672.
DOI: 10.7868/S0016675814060071
Прокариотам свойственны межклеточные взаимодействия, которые опосредованы синтезом, секрецией и рецепцией низкомолекулярных сигнальных соединений (НСС) [1]. "Химическая коммуникация" между бактериями лежит в основе явления кворум-сенсинга — особого типа регуляции экспрессии генов бактерий, зависящего от плотности их популяций и концентрации синтезируемых НСС [1, 2]. Такие коммуникативные системы распространены и среди актиномицетов — представителей класса Actinobacteria, основных промышленных продуцентов антибиотиков, и они базируются на соединениях бутенолидного класса [3—6]. НСС участвуют в регуляции морфогенеза и вторичного метаболизма актиномицетов [7—10]. В настоящее время у семи видов актиномицетов идентифицированы 14 различных НСС, относящихся к семейству у-бутиролактонов [10]. Они способны взаимодействовать с белками-ре-прессорами, связанными с операторными участками определенных генов, и таким образом влиять на транскрипцию генов [8, 9]. Наиболее подробно изучен один из представителей у-бутиролактонов — 2-(6'-метилгептаноил)-3Я-гидроксиметил-4-бута-нолид (А-фактор) — положительный регулятор синтеза стрептомицина и морфогенеза у Streptomyces griseus [10].
Недавно у актиномицетов была обнаружена вторая группа бутенолид-подобных НСС, являющихся производными фурана. К ним относятся метиленомицинфураны S. coelicolor и авенолиды S. avermitilis, которые, соответственно, участвуют в регуляции продукции антибиотиков метилено-мицина и авермектина [11, 12]. По данным био-информатического анализа [11], некоторые гены биосинтеза авенолид-подобных НСС имеются также в геномах еще нескольких актиномицетов, в том числе S. ghanaensis АТСС14672. Интерес к этому штамму обусловлен его способностью продуцировать фосфогликолипидный антибиотик моеномицин (Мм), в частности моеномицин А (МмА; рис. 1), который является главным компонентом смеси моеномицинов штамма АТСС14672. МмА прямо ингибирует пептидогликановые гли-козилтрансферазы — жизненно важный класс белков, участвующих в синтезе клеточной стенки бактерий [13]. Сегодня не описаны другие антибиотики, которые имели бы идентичный или похожий механизм антибактериального действия. Исходный уровень продукции моеномицинов (Мм) штаммом АТСС14672 очень низок. Это побуждает к исследованию механизмов регуляции биосинтеза Мм. В этом направлении уже достаточно детально изучены некоторые транскрипционные и
O
HO IL
HO HO R2H2C
OH O
O
OH NHAc
•J HO4/(
NH2
O
NHAc v
/Р
OH
CO2H
Моеномицин А Ri
Нозокомицин В2 Ri
NH R
I R2
ho^V^O
nh2
R2
H
OH
Рис. 1. Структурные формулы моеномицинов, упомянутые в тексте. Моеномицин А — основной продукт пути биосинтеза Мм в S. ghanaensis АТСС14672. Нозокомицин накапливается штаммом S. lividans 1326, несущим космиду тоепо38-5.
трансляционные регуляторные механизмы [13, 14]. Однако роль НСС в биосинтезе Мм оставалась неизученной. Следует отметить, что для изучения регуляции синтеза Мм в предыдущих исследованиях использовали методы гетерологиче-ской экспрессии генов биосинтеза Мм (moe-генов) в клетках S. coelicolor, S. lividans, S. albus [13, 14]. Это связано со сложностью осуществления нокаутов генов в ATCC14672, сравнительно высоким уровнем синтеза Мм в клетках гетероло-гических хозяев, а также тем, что в их геномах аннотированы гомологи плейотропных регуляторов вторичного метаболизма S. ghanaensis. Поэтому в данной работе поставлены следующие задачи: аннотировать все структурные и регуляторные гены НСС S. ghanaensis; изучить возможную роль НСС в продукции моеномицинов при помощи сверхэкспрессии некоторых генов биосинтеза НСС; оценить влияние делеции гена синтазы у-бутиро-лактонов scbA S. lividans M707 на гетерологиче-скую продукцию Мм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для поиска генов, контролирующих биосинтез и рецепцию НСС S. ghanaensis АТСС14672, был использован черновой вариант его генома и программа BLASTР, доступные на NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov).
В работе использованы штамм S. coelicolor М145 (производный штамма дикого типа, который не содержит плазмид SCP1 и SCP2, продуцент актинородина), штамм-продуцент моено-мицина А дикого типа S. ghanaensis АТСС14672, а также его мутанты: а) по гену транскрипционного активатора adpAgh с поврежденным формирова-
нием воздушного мицелия [14]; б) с делецией гена пренилтрансферазы moeO5, которая катализирует первую реакцию синтеза МмА [15]; в) с делецией гена ssfg_05654 (транскрипционного регулятора семейства GntR), который потерял способность формировать воздушный мицелий на среде TSB
[16]. Использован также штамм дикого типа S. lividans 1326 [17] и штамм S. lividans M707 с делецией гена scbA — синтазы бутиролактон-подобных НСС [3], который предоставлен проф. Э. Такано (Манчестерский университет, Великобритания). Мутант S. griseus IFO13350 с нарушенным синтезом А-фактора [5, 18, 19] получен от проф. Б.П. Маце-люха (Ин-т микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАНУ, Киев). Штаммы Escherichia coli DH5a и ET12567 (pUZ8002), которые использовали для создания и конъюгационного переноса рекомбинантных плазмид, описаны в
[17]. S. ghanaensis ATCC14672, S. lividans 1326, S. lividans M707 и их производные выращивали на овсяной среде, агаризованной среде TSB (трип-тон — 17 г, глюкоза — 2.5 г, NaCl — 5 г, K2HPO4 — 2.5 г, гидролизат сои — 10 г, H2O (дист.) — 1 л) и в жидкой среде sTSB (упрощенная среда TSB: трип-тон - 17 г, NaCl - 5 г, K2HPO4, - 2.5 г). Штаммы E. coli выращивали по стандартным методикам [17]. В среды для выращивания рекомбинантных штаммов актиномицетов и E. coli вносили антибиотики апрамицин (Am) и канамицин (Km) в концентрации 50 мкг/мл. Структурные и регуля-торные гены биосинтеза НСС S. ghanaensis были клонированы в вектор pKC1139, содержащий термочувствительный репликон плазмиды pSG5 [17]. Рекомбинантные плазмиды и космиду moeno38-5, несущую фрагмент кластера moe-ге-нов и контролирующую синтез предшественника
Компоненты гормональных систем S. ghanaensis и их гомологи в S. coelicolor, S. griseus и S. avermitilis
Streptomyces ghanaensis ATCC14672
Гомологии
№ белок функция ген белок штаммы сходство, %
1 Ssfg_07724 Рецептор бутиролактонов scbR Рецептор А-фактора S. coelicolor 46
2 Ssfg_07725 (AfsAgh) Регулятор/необходимый для синтеза НСС afsA A-фактор-синтаза S. griseus 44
3 Ssfg_07843 TetR-подобный регулятор scbR TetR-подобный рецептор А-фактора S. coelicolor 45
4 Ssfg_07848 (AvaRgh) Авторегуляторный рецепторный белок avaR Рецептор авенолида S. avermitilis MA-4680 75
5 Ssfg_07849 Ацил-КоА оксидаза aco Ацил-КoA оксидаза S. avermitilis MA-4680 48
6 Ssfg_01628 TetR-подобный рецептор А-фактора cprA ArpA-подобный рецептор S. coelicolor 76
МмА — нозокомицина В2 (рис. 1), переносили в штаммы актиномицетов при помощи межродовой конъюгации с E. coli по методике, описанной в [13].
Выделение препаратов суммарной и плазмид-ной ДНК, обработку ДНК эндонуклеазами рестрикции, Т4-ДНК-лигазой, электрофоретиче-ский анализ ДНК, трансформацию E. coli проводили, как описано в [17]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили, как описано в [17], с использованием PTC100 MiniCycler ("MJ Research", США). ДНК секвенировали методом Сенгера на базе Отдела биополимеров Гарвардской медицинской школы (Бостон, США).
Очистку Мм из биомассы и количественный анализ методом диффузии антибиотика в агар и высокоэффективной жидкостной хроматографии выполняли, как описано в [13, 14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Биоинформатический анализ генов S. ghanaensis, участвующих в биосинтезе НСС
Анализ in silico показал наличие в геноме S. ghanaensis шести генов, кодирующих вероятные структурные, регуляторные и рецепторные белки, участвующие в метаболизме НСС бутиро-лактонного типа (у-бутиролактоны и авенолиды). Гомологи этих генов S. ghanaensis присутствуют в геномах модельных штаммов S. coelicolor, S. griseus и S. avermitilis (таблица).
Компонентом первой гормональной системы S. ghanaensis является продукт гена ssfg_07725 — белок AfsAgh. Как и его гомологи (таблица), он содержит домен FabZ, функционирующий как тио-естердегидратаза, и участвует в процессах метаболизма жирных кислот, промежуточные продукты которого являются предшественниками в про-
цессе синтеза А-фактора [12, 20]. Ген ssfg_07725 расположен на одном из концов линейной хромосомы S. ghanaensis рядом с дивергентно расположенным геном ssfg_07724, белковый продукт которого является вероятным рецептором А-фак-тора. Ген ssfg_01628 ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.