научная статья по теме ГЕНЫ ЛАМИНИНОВ, КОНСТИТУТИВНО И АНОМАЛЬНО МЕТИЛИРОВАННЫЕ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ГЕНЫ ЛАМИНИНОВ, КОНСТИТУТИВНО И АНОМАЛЬНО МЕТИЛИРОВАННЫЕ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 667-677

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.218

ГЕНЫ ЛАМИНИНОВ, КОНСТИТУТИВНО И АНОМАЛЬНО МЕТИЛИРОВАННЫЕ ПРИ РАКЕ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

© 2015 г. О. А. Симонова1, Е. Б. Кузнецова1, 2, Е. В. Поддубская3, Т. В. Кекеева1, 2, Р. А. Керимов3, И. Д. Троценко4, А. С. Танас1, 2, 5, В. В. Руденко1, 2, Е. А. Алексеева1, 2, Д. В. Залетаев1, 2, 5, В. В. Стрельников1, 2, 5*

Медико-генетический научный центр, Москва, 115478 2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 119991 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Москва, 115478

4Российский университет дружбы народов Министерства образования и науки Российской Федерации,

Москва, 117198

5Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Министерства

здравоохранения Российской Федерации, Москва, 117997 Поступила в редакцию 10.10.2014 г. Принята к печати 26.01.2015 г.

Ламинины, белки семейства внеклеточных гликопротеинов, — важнейший компонент базальных мембран, вовлечены в целый ряд биологических процессов, включая дифференцировку тканей, заживление ран и он-когенез. Изучено метилирование промоторных участков 12 генов, кодирующих белки этого семейства, в нормальных тканях (лейкоциты периферической крови, клетки буккального эпителия, аутопсийные образцы тканей молочной железы) и в операционном материале рака молочной железы. На основании полученных результатов выделены три группы генов ламининов. Гены, конститутивно метилированные в ткани молочной железы — LAMA3A, LAMB2, LAMB3, LAMC2. Гены, подверженные аномальному метилированию при раке молочной железы — LAMA1, LAMA2, LAMA3B, LAMA4, LAMB1, LAMC3. Гены, не показавшие значимых частот метилирования при раке молочной железы — LAMA5, LAMC1. Группа конститутивно метилированных генов включала все гены субъединиц ламинина-5 (историческое название ламинина 332), промоторы которых ранее считались неметилированными в нормальных тканях и подверженными аномальному метилированию при раке молочной железы.

Ключевые слова: ламинин, рак молочной железы, метилирование ДНК.

DNA METHYLATION IN THE PROMOTER REGIONS OF THE LAMININ FAMILY GENES IN NORMAL AND BREAST CARCINOMA TISSUES, by O. A. Simonova1, E. B. Kuznetsova1'2, E. V. Poddubskaya3, T. V. Kekeeva1, R. A. Kerimov3,I. D. Trotsenko4, A. S. Tanas1'2' 5, V. V. Rudenko1' 2, E. A. Alekseeva1' 2, D. V. Zaletayev1'2'5, К К Strelnikov1'2'5'* ^Research Centre for Medical Genetics, Moscow, 115478 Russia; 2Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, 199991 Russia; *e-mail: vstrel@mail.ru; 3Blokhin Russian Cancer Research Center, Moscow, 115478 Russia; 4Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, 117198 Russia; 5Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, 117997 Russia). Extracellular glycoproteins of the laminin family are essential components of basement membranes involved in a number of biological processes, including tissue differentiation, wound healing and tumorigenesis. We present the first comprehensive study of promoter methylation status of the genes encoding laminin chains in normal tissues (peripheral blood leucocytes, buccal epithelial cells, autpsy breast tissue samples) and in breast carcinoma samples. Based on the results of this study we divide laminin genes into three categories. Genes, constitutively methylated in breast tissues — LAMA3A, LAMB2, LAMB3, LAMC2. Genes, prone to abnormal methylation in breast carcinoma — LAMA1, LAMA2' LAMA3B' LAMA4, LAMB1, LAMC3. Genes, rarely if ever methylated in breast carcinoma, LAMA5, LAMC1. The constitutively methylated group includes all the genes encoding subunits of laminin-5 (the historical name of laminin 332), the promoters of which were previously considered unmethylated in normal tissues and prone to abnormal methylation in breast cancer.

Keywords: laminin, breast cancer, DNA methylation. DOI: 10.7868/S0026898415040163

* Эл. почта: vstrel@list.ru

Согласованность морфогенных и пролифера-тивных сигналов — важное условие нормального развития и обеспечения тканевой специфичности и архитектуры. В ходе развития опухоли эта согласованность регуляции нарушается, что позволяет злокачественным клеткам пролиферировать и вторгаться в окружающие ткани. Изменение структурной организации ткани является одним из ранних признаков малигнизации, а опухоли с наиболее выраженными нарушениями организации эпителия имеют наихудший прогноз [1].

Важный компонент внеклеточного матрикса — семейство белков ламининов — участвует в процессах поддержания архитектоники ткани, передаче сигналов в клетки и обеспечении активного взаимодействия эпителия и подлежащей стромы. Эти гликопротеины представляют собой гетеро-тримеры, состоящие из а-, в- и у-цепей, связанных дисульфидными связями и образующих крестообразную структуру. Известны три группы генов ламининов, кодирующих а-цепи (пять генов, один из которых кодирует две изоформы), в-цепи (четыре гена) и у-цепи (три гена). Продукты этих генов взаимодействуют друг с другом в различных комбинациях и образуют 16 белков семейства ламининов [2]. Современная классификация ламининов отражает субъединичный состав гетеро-тримеров. Например, название ламинина 421 говорит о том, что он состоит из продуктов генов ММЛ4, ЬЛМБ2 и ЬЛМС1 [3].

О колоссальной роли ламининов в морфогенезе молочной железы (МЖ), поддержании структуры ацинуса и функционировании эпителия свидетельствуют результаты ряда работ [4—6]. Изменение содержания ламининов в ткани может быть критическим событием, которое ведет не только к нарушению архитектоники, но и к изменению экспрессии генов в клетках МЖ. Считается также, что снижение синтеза ламининов при раке способствует инвазии опухоли в окружающие ткани и метастазированию [7].

Один из механизмов регуляции экспрессии генов — метилирование их промоторных областей. В настоящей работе определен характер метилирования промоторных областей генов субъединиц ламининов с целью выявления новых маркеров метилирования ДНК при раке МЖ (РМЖ).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клинический материал. Проанализировано 186 образцов РМЖ, 186 парных им образцов прилежащей морфологически неизмененной ткани, шесть аутопсийных образцов нормальной МЖ, 30 образцов периферической крови и семь образцов буккального эпителия здоровых доноров. Образцы биологического материала предоставлены Российским онкологическим научным

центром им. Н.Н. Блохина, Московским научно-исследовательским онкологическим институтом им. П.А. Герцена, Медико-генетическим научным центром. Образцы тканей после взятия замораживали и хранили в жидком азоте.

Медиана возраста женщин, больных РМЖ, и ее стандартное отклонение составили 56 ± 12 лет.

Из 186 образцов 76.3% (142/186) представляли протоковый РМЖ, 12.9% (24/186) — дольковый, 7.5% (14/186) — смешанный. Микропапиллярная карцинома, слизистый, медуллярный и метапла-стический типы РМЖ были представлены единичными случаями.

На момент постановки диагноза стадию I заболевания имели 9.6% (18/186), IIA - 42% (78/186), IIB - 31.2% (58/186), IIIA - 7.5 (14/186), IIIB - 6% (11/186), IIIC - 1% (2/186), IV - 2.7% (5/186) больных.

Согласно TNM-классификации для новообразований РМЖ выборка была разделена на подгруппы в зависимости от размера первичной опухоли (Т1 - 21% (39/186), Т2 - 67.2% (125/186), Т3 - 6% (11/186), Т4 - 6% (11/186)), состояния регионарных лимфатических узлов (N0 - 47.3% (88/186), N1 - 44% (82/186), N2 - 8% (15/186), N3 - 0.5% (1/186)), наличия отдаленных метастазов (М0 -97.3% (181/186), М1 - 2.7% (5/186)). По степени дифференцировки первичной опухоли образцы разделились следующим образом: G1 - 2.7 (5/186), G2 - 69.4% (129/186), G3 - 28% (52/186). Проведено иммуногистохимическое исследование всех образцов с антителами к рецепторам эстрогенов и прогестеронов, а также к онкобелку Her2/neu.

Выделение ДНК и метилчувствительная ПЦР (МЧ-ПЦР). Геномную ДНК выделяли с использованием стандартного метода фенол-хлороформной экстракции. Гидролиз ДНК проводили в смеси 1.5 мкг геномной ДНК, 10 ед. акт. фермента НраП, 2 мкл буфера SEBufferY (х10) ("СибЭнзим", Новосибирск). Объем смеси доводили до 20 мкл деионизированной водой и инкубировали в течение 16 ч при температуре 37°С. Основным методом в данной работе была МЧ-ПЦР С целью исключения ложноотрицательных и ложно-положительных результатов для каждого локуса была разработана схема ПЦР с тремя парами прайме-ров: один фрагмент принадлежал исследуемому гену, второй служил положительным контролем (конститутивно метилированный участок гена CUX1), третий - контролем полноты гидролиза ДНК (конститутивно неметилированный участок гена SNRK). ПЦР проводили в смеси следующего состава: 0.1 мкг ДНК, 0.05 мкМ каждого олиго-праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 2.5 мкл десятикратного буфера для ПЦР (50 мМ КС1, 10 мМ Трис-НС1 pH 8.4), деионизированной воды до 25 мкл. Оптимальное содержание MgC12 в

ПЦР-смеси определяли экспериментальным путем для каждой пары праймеров. Реакционную смесь прогревали при 95°С в течение 5 мин и проводили 33 цикла ПЦР в следующем режиме: 95°С — 40 с, Тотж. (табл. 1) - 40 с, 72°С - 40 с. Последнюю элонгацию проводили при 72°С в течение 10 мин.

Нуклеотидные последовательности праймеров, температуры отжига, концентрации М§С12 и размер продуктов ПЦР приведены в табл. 1. Продукты МЧ-ПЦР разделяли в 8%-ном полиакрила-мидном геле и окрашивали нитратом серебра.

Бисульфитное секвенирование. Результаты анализа метилирования промоторных областей исследуемых генов, полученные с помощью МЧ-

ПЦР, подтверждали с помощью бисульфитного секвенирования соответствующих фрагментов. Дизайн праймеров (табл. 2) был выполнен при помощи программы МеШРйшег [8]. Секвениро-вали только участки промоторных областей генов ламининов, состояние метилирования которых значимо различалось в нормальных и опухолевых тканях МЖ.

Для проведения бисульфитной конверсии геномную ДНК денатурировали в присутствии №ОН (конечная концентрация 0.3 М) при температуре 65°С в течение 15 мин

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»