ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 3, с. 356-362
^ ОБЩАЯ
ГЕНЕТИКА
УДК 575.17:595.773.4
ГЕНЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ РАЗВИТИЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ, ОПРЕДЕЛЯЮТ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ
ЖИЗНИ Drosophila melanogaster
© 2007 г. Н. В. Рощина, Е. Г. Пасшкова
Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва 123182; факс: (495)196-19-09; e-mail: egpas@rambler.ru Поступила в редакцию 27.07.2006 г.
Ранее было показано, что в цитологических районах 7A6-B2, 36E4-37B9, 37B9-D2 и 64C-65C локализованы гены, определяющие различия в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа - 2b и Oregon. Были проведены количественные комплементационные тесты между мутациями генов, локализованных в этих районах и участвующих в биосинтезе катехоламинов (iav (inactive), Catsup (Catecholamines up), amd (alpha metil dopa-resistant), Dox-A2 (Diphenol oxidase A2), ple (pale)) и контроле развития нейронов (Fas3 (Fasciclin 3), tup (tail up), Lim3), с одной стороны, и двумя разными нормальными аллелями этих генов в линиях 2b и Oregon - с другой стороны. Комплементация была выявлена для генов iav, Fas3, amd и ple. Остальные гены (Catsup, Dox-A2, tup и Lim3) являются генами-кандидатами, потенциально определяющими различия в продолжительности жизни между 2b и Oregon.
В последнее время достигнут значительный прогресс в понимании того, какие гены участвуют в регуляции продолжительности жизни. Один из наиболее интересных и важных итогов проводимых исследований заключается в том, что генетические основы контроля продолжительности жизни сходны у самых отдаленных организмов -от дрожжей до человека. Примером такого эволюционного консерватизма является система генов, вовлеченных в регуляцию инсулин-зависимого сигнального пути. Мутации в генах этой системы увеличивают продолжительность жизни у дрожжей, нематоды, дрозофилы и мыши (см. обзоры [1-4]). В контроль продолжительности жизни вовлечены также гены, регулирующие устойчивость к окислительному стрессу и тепловому шоку, репарацию ДНК, сайленсинг хроматина и некоторые другие [1-4]. Однако очевидно, что не все генетические механизмы контроля продолжительности жизни уже известны.
В последнее время становится ясно, что нервная система играет ключевую роль в контроле продолжительности жизни [5]. Суперэкспрессия ряда генов исключительно в нервных клетках, а в некоторых случаях даже исключительно в мотонейронах, приводит к росту продолжительности жизни целого организма [6].
Продолжительность жизни представляет собой количественный признак, который характеризуется сильной внутри- и межпопуляционной изменчивостью, которая в существенной степени определяется условиями окружающей среды [7]. Генетическая составляющая этой изменчивости,
существование которой в природных популяциях подтверждается селекционными экспериментами (см., например, [8]), остается пока неизученной, несмотря на значительные успехи в исследовании генетического контроля продолжительности жизни в целом.
Цель нашей работы заключается в поиске новых генов, контролирующих продолжительность жизни и отвечающих за изменчивость по этому количественному признаку у дрозофилы. В результате рекомбинационного картирования ранее было обнаружено несколько крупных участков хромосом, в которых локализованы гены, ответственные за различия в продолжительности жизни между двумя линиями дрозофилы [7, 9]. Уточнение локализации, проведенное с помощью теста на комплементацию с делециями, перекрывающими некоторые из ранее выявленных участков хромосом, обнаружило по крайней мере 15 небольших районов потенциальной локализации генов, которые контролируют продолжительность жизни и аллели которых различаются в двух исходных линиях мух, обусловливая изменчивость признака [10, 11]. Следующим шагом в исследовании является комплементационный тест с мутациями генов-кандидатов, локализованных в этих районах. Проведение таких тестов с мутациями генов Ddc и stc подтвердило их роль в контроле продолжительности жизни [11, 12]. Ген Ddc (Dopa decarboxylase) кодирует дофадекарбок-силазу, являющуюся ключевым ферментом биосинтеза катехоламинов, необходимым для превращения дофа в дофамин и 5-гидрокситрипто-
фана в серотонин; оба вещества принимают участие в передаче нервного импульса. Ген stc (shuttle craft) кодирует транскрипционный фактор, вовлеченный в контроль развития мотонейронов. Таким образом, оба выявленных гена связаны с развитием и функционированием нервной системы.
Для дальнейшего исследования мы также выбрали гены-кандидаты, связанные с развитием и функционированием нервной системы. В данной работе мы представляем некоторые результаты комплементационных тестов со следующими из них: ген iav (inactive) участвует в метаболизме ка-техоламинов; ген Catsup (Catecholamines up) является регулятором тирозингидроксилазы - ключевого фермента биосинтеза дофа; гены amd (alpha metil dopa-resistant) и Dox-A2 (Diphenol oxidase A2) участвуют в метаболизме катехоламинов, необходимых для отвердевания и окрашивания кутикулы; ген ple (pale) кодирует тирозингидроксила-зу; ген Fas3 (Fasciclin 3) необходим для развития нейронов; ген tup (tail up) кодирует транскрипционный фактор, вовлеченный в развитие нейронов, а также других типов клеток; ген Lim3 кодирует транскрипционный фактор, участвующий в развитии нейронов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии Drosophila melanogaster. Неродственные друг другу изогенные лабораторные линии дикого типа 2b и Oregon описаны ранее [13]. Линии с мутациями (табл. 1) были получены из Центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США).
Скрещивания и измерение продолжительности жизни. Девственных самок линий 2b и Oregon скрещивали с самцами каждой из исследуемых мутантных линий. Потомки этих скрещиваний имели следующие генотипы: 2b/mut, 2b/Bal и Oregon/mut, Oregon/Bal, где mut обозначает хромосому с мутацией, а Bal - хромосому-балансер, на фоне которой каждая из мутаций поддерживалась в линии (табл. 1). По пять девственных мух одного пола и генотипа отбирали в течение дня и помещали в пробирку на стандартный корм. Всего для каждого пола и генотипа в течение нескольких дней собирали по 4 или 5 таких пробирок, т.е. по 20 или 25 особей. Случайно вылетавшие из пробирок мухи уменьшали выборки для некоторых генотипов только на 1 особь. Мутации одного гена исследовали одновременно. Количество живых мух в пробирке регистрировали каждый день. Продолжительность жизни определяли как число прожитых данной особью дней. Оставшихся в живых мух пересаживали на свежий корм каждые 5-7 дней. Все культуры и скрещивания вели при 25°C.
Таблица 1. Линии дрозофилы, использованные в работе
Генотип линии Балансер Цитологическая локализация
iav1 FM7c, wasnX2vOfg4 B1 7A5-C1
beat-la3 Fas3E25 CyO 36F2-4
tup1 cn1 bw1 sp1 CyO 37B1
tupis1-1 rdo1 hk1 pr1 CyO 37B1
Catsup1 rdo1 hk1 pr1 CyO 37B9-12
Catsupcs1 pr1 CyO, Cy1dplv1pr1cn2 37B9-12
Catsupcs2 cn1 bw1 CyO, Cy1dplv1pr1cn2 37B9-12
DOX-A21 pr1 CyO 37B9-13
Dox-A22 pr1 or49h CyO, Cy1dplv1pr1cn2 37B9-13
Dox-A2mfs1 pr1 CyO 37B9-13
amd1 CyO 37B11-C1
amd6 CyO, Cy1dplv1pr1cn2 37B11-C1
amd9 cn1 bw1 CyO, Cy1dplv1pr1cn2 37B11-C1
Lim31 pr1 CyO 37B13-C1
Lim32 CyO 37B13-C1
ple4 st1 e1 TM3, Sb1 65C3
Примечание. Жирным шрифтом выделены исследуемые нами мутации.
Статистический анализ количественного теста на комплементацию. Принципы анализа количественного комплементационного теста подробно описаны в [10, 12]. Классический качественный тест на комплементацию используется для исследования мутаций, приводящих к хорошо выраженному изменению какого-либо качественного признака. Аллельность рецессивной тестерной мутации mut и мутации в гене-кандидате mut* предполагает существование фенотипи-ческих различий по соответствующему признаку между особями mut*/mut и mut*/+, у которых мутация в гене-кандидате находится на фоне тестерной мутации (мутантный фенотип) и на фоне ал-леля дикого типа (дикий тип). Мы исследовали небольшие различия в продолжительности жизни, обусловленные тем, что в линиях 2b и Oregon присутствуют различные аллели генов-кандидатов, контролирующих этот признак. Следовательно, нас интересовали те случаи, когда фено-
типическая разница между аллелями гена-кандидата в двух исследуемых линиях заметна на фоне мутантного аллеля mut, но незаметна на фоне ал-леля дикого типа, присутствующего в хромосоме Bal, т.е. когда (mut2b/mut - mutOregon/mut) Ф Ф (mut2b/Bal - mutOregon/Bal). Для анализа данных о продолжительности жизни самцов (самок) четырех генотипов, появляющихся в потомстве от скрещивания 2b и Oregon с каждой из мутантных линий, мы использовали двухфакторный дисперсионный анализ, рассматривая в качестве фиксированных главных факторов Линию (Л, 2b или Oregon) и Генотип (Г, мутация mut или балансер Bal). Достоверность взаимодействия двух факторов, Л х Г, т.е. справедливость неравенства (mut2b/mut -- mutOregon/mut) Ф (mut2b/Bal - mutOregon/Bal), служит указанием на некомплементарность. Иначе говоря, ген, мутация в котором используется в опыте, имеет в линиях 2b и Oregon аллели, по-разному влияющие на продолжительность жизни. Однако с учетом неоднородности генетического фона в наших опытах достоверность Л х Г может быть объяснена не только аллельными, но и эпистати-ческими взаимодействиями. В связи с этим дополнительным критерием для отбора случаев ал-лельного взаимодействия служило соблюдение неравенства mut2b/mut - mutOregon/mut Ф 0 при mut2b/Bal - mutOregon/Bal = 0. В этом случае аллели кандидатного гена, присутствующие в линиях 2b и Oregon, демонстрировали достоверные различия по продолжительности жизни на фоне мутантно-го аллеля этого гена и отсутствие этих различий на фоне аллеля дикого типа. Линии 2b и Oregon не различаются по продолжительности жизни. Учитывая такую особенность нашей модельной системы, мы рассматривали достоверность фактора Л как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия, описанного выше. В тех случаях, когда в работе были использованы несколько мутаций одного гена, трехфакторный дисперсионный анализ (отдельно для самцов и самок) проводили также для всей совокупности данных
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.