БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 9, с. 1405 - 1419
УДК 577.152.2
ГЕПАРАНСУЛЬФАТ 6-СУЛЬФОТРАНСФЕРАЗА 3 ПРИНИМАЕТ УЧАСТИЕ В ОСТЕОГЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ МЕЗЕНХИМНЫХ КЛЕТОК СТРОМЫ КОСТНОГО МОЗГА*
© 2015 Шанченг Жао1, Чао Денг2, Жен Ванг1, Липинг Тенг2, Джинхуа Чен1,3**
1 School of Pharmaceutical Science, Jiangnan University,
Wuxi 214122, PR China; E-mail: zhaoshancheng2008@163.com 2 Jiangnan University, Wuxi medical school, Wuxi 214122, PR China
3 Jiangnan University, Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Wuxi 214122, PR China;
E-mail: jhchenwhut@126.com
Поступила в редакцию 21.10.14 После доработки 13.01.14
Наши знания о роли таких соединений, как гепарансульфат (HS), участвующих в процессах воспроизводства/самообновления и дифференцировки стволовых клеток очень незначительны. HS представляет собой линейную сульфатированную полианионную полисахаридную цепочку, состоящую из повторяющихся ди-сахаридных звеньев. HS может взаимодействовать со многими белками, включая структурные белки внеклеточного матрикса (ВКМ), а также с факторами роста и их рецепторами. Таким образом, изучение роли HS в самообновлении и дифференцировке стволовых клеток способствует выяснению теоретических основ и поискам новых методов использования этих клеток в клинике. Мы изолировали и очистили мезенхимные клетки стромы костного мозга (BMMSC) методом центрифугирования в градиенте плотности Перкола, провели методом проточной цитофлуорометрии анализ характерных для стволовых клеток поверхностных белков-маркеров, а также идентифицировали экспрессированные в клетках сульфотрансферазы, осуществляющие модификацию HS. Остеогенная дифференцировка, вызванная обработкой BMMSC химическими индукторами, была подтверждена наблюдениями за активностью щелочной фосфатазы (ALP) и экспрессией белковых маркеров Runx2 и Ocn. Методами обратной транскрипции-ПЦР (ОТ-ПЦР) и иммуноблот-тинга были идентифицированы сульфотрансферазы, экспрессированные в недифференцированных и индуцированных к дифференцировке BMMSC крысы. Установлено, что при высокой степени плотности монослоя, как в контрольной, так и дифференцирующейся культуре формировались клеточные сфероиды. Гистохимические исследования показали, что этот тип клеточного сфероида содержал обогащенные соединениями кальция (кальцифицированные) узелки. Среди всех исследованных сульфотрансфераз, в кальци-фицированных клеточных сфероидах наблюдалось увеличение транскрипционной и трансляционной экспрессии только гепарансульфат 6-сульфотрансферазы 3 (HS6ST3). «Нокдаун» HS6ST3 в клетках BMMSC с помощью интерферирующей shPHK сопровождался снижением активности ALP и подавлением экспрессии маркеров остеогенной дифференцировки Runx2 и Ocn. Полученные результаты позволяют предположить, что HS6ST3 принимает участие в дифференцировке BMMSC. Возможно, что в будущем могут быть предложены новые клинические методы, основанные на гликотерапии.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: BMMSC, остеогенная дифференцировка, внеклеточный матрикс, гепарансульфат, сульфотрансфераза.
По мере расширения исследований генома все большее внимание привлекает изучение генов гликопротеинов, участвующих в регуляции прогрессии опухолей и воспроизводстве и дифференцировке стволовых клеток [1]. Стволовые клетки — это специфическая популяция поли-
* Английский вариант рукописи был опубликован в журнале «Biochemistry» (Moscow), том 80, вып. 3, 379—389.
** Адресат для корреспонденции.
потентных клеток, способных к самовоспроизводству и дифференцировке в клетки различных типов, что открывает широкие возможности для их использования в регенеративной терапии [2]. Пути развития стволовых клеток жестко контролируются с помощью различных ростовых факторов, модулируемых полисахаридными цепочками протеогликанов. Гепарансульфат (Н8)-содержащие протеогликаны — это один из подтипов протеогликанов, участвующих во множе-
стве биологических процессов, включающих имплантацию зародыша, тканевый морфогенез, заживление ран, образование новых кровеносных сосудов и регуляцию дифференцировки стволовых клеток. Ж-содержащие протеогли-каны оказывают свое воздействие на клеточные процессы путем регуляции активности ростовых факторов и создания морфогенных градиентов [3, 4].
Мезенхимные клетки стромы, полученные из костного мозга взрослого организма, обладают рядом преимуществ над эмбриональными стволовыми клетками при их использовании в клинике: запас этих клеток довольно значителен, они не инвазивны, их легко получить без риска для донора и, наконец, они были слабо иммуногенными для реципиента [5]. Протеино-подобные биореагенты, используемые в настоящее время для стимуляции процессов воспроизводства и дифференцировки стволовых клеток, подвержены быстрой инактивации и оказывают побочные воздействия на организм. Успешное извлечение мезенхимных клеток стромы является первым этапом их использования в тканевой терапии. Техника их дальнейшей трансплантации все еще находится в процессе разработки. Более того, пока еще мало известно о регуляции процесса выбора этими клетками путей дифференцировки в клетки различных тканей. В данной работе была изучена роль Ж в некоторых из этих процессов.
Важнейшими факторами, определяющими судьбу стволовых клеток, являются сигнальные белковые молекулы. Установлено, что картина экспрессирующихся белков, среди которых отмечены ростовые факторы и компоненты ВКМ, сильно меняется в процессе развития стволовых клеток [6]. Кроме того, экспрессия различных белков в стволовых клетках тесно связана с клеточным окружением. Хорошо известно также, что биологические макромолекулы, в том числе гликозаминогликаны и РНК, также принимают участие в регуляции этих процессов путем взаимодействия с различными белками [7—11]. Существенным является тот факт, что такие гликозаминогликаны, как Ж и хондрои-тинсульфат (С8), очень стабильны и синтезируются в значительных количествах [12]. Различные аминогликаны интенсивно исследуются с целью применения в качестве вспомогательных компонентов для тканевой терапии [7—10, 13], однако механизмы их регуляторного воздействия на белки неизвестны. В данной работе мы изучали воздействие гепарановых сульфотранс-фераз на остеогенную дифференцировку ме-зенхимных клеток стромы костного мозга (ВММ8С) крыс. Был также разработан уско-
ренный метод изоляции BMMSC и представлен расширенный протокол для изучения биологической активности HS. Поскольку физиология крыс во многом сходна с человеческой, эти клетки являются подходящей моделью для дальнейших исследований.
Предполагается, что HS служит связующим звеном в функционировании вне- и внутриклеточных сигнальных систем [6, 14]. В частности, сейчас активно исследуется взаимодействие HS с белками семейства фактора роста фиброблас-тов (FGF). HS вызывает димеризацию FGF и активацию тирозинспецифической протеин-киназы рецепторов этих факторов. Установлено, что для такой активации необходимо наличие сульфогрупп в положениях 2-О и 6-О гепа-рансульфата [15]. Мезенхимные клетки стромы в костном мозге окружены внеклеточным мат-риксом, локально обогащенном FGF2 и содержащем HS, что может способствовать переходу этих клеток из состояния покоя в состояние быстрого самовоспроизводства в процессе репарации ткани. Более того, такое микроокружение может регулировать образование предшественников костной ткани (остеобластов) при участии RUNX2 (runt-related transcription factor 2) [16, 17]. Известно, что BMP2 (Bone morpho-genetic protein 2) также может индуцировать ос-теогенную дифференцировку клеток BMMSC [3]. Оба ростовых фактора (FGF2 и BMP2) способны связывать HS. Связывание с HS может защищать эти факторы от протеолитической деградации, а также образующиеся комплексы (FGF2-HS или BMP2-HS) могли бы стимулировать регуляторные сигнальные клеточные пути [6, 18]. В частности, добавление к клеткам BMMSC крыс гепарансульфата, экстрагированного из нейроэпителиальных клеток мышей, способствовало стимуляции их пролиферации и дальнейшей остеогенной дифференцировке in vitro посредством воздействия на рецептор FGF1 [4].
Ранее методом жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией и путем анализа связывания лектинов было показано, что степень сульфатирования макромолекул в клетках BMMSC увеличивалась после индукции их дифференцировки в остеобласты [19], однако ответственные за эти изменения сульфотранс-феразы не были идентифицированы. В данной работе были изолированы мезенхимные клетки стромы из костного мозга крыс и на их основе создана модель остеогенной дифференцировки с использованием химических индуцирующих реагентов. Уровни экспрессии различных HS сульфотрансфераз в клетках BMMSC до и после индукции дифференцировки были определены
методом ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга. Мы показали, что уровни транскрипционной и трансляционной экспрессии сульфогепаран 6-суль-фотрансферазы 3 (HS6ST3) возрастали в сильно кальцифицированных клеточных сфероидах. Это наблюдение дало возможность предположить, что сульфоэфирная модификация гепарина требуется для процесса дифференцировки стволовых клеток. Для дальнейшего исследования роли HS6ST3 в остеогенной дифференци-ровке BMMSC был проведен «нокдаун» HS6ST3 с помощью интерферирующей малой РНК (shPHK-плазмида) и показано, что при этом существенно снижался остеогенный потенциал этих клеток. Наши исследования могут послужить для выработки новых технических приемов манипуляции со стволовыми клетками при проведении тканевой терапии.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изоляция BMMSC крыс и их характеристика методом проточной цитофлуорометрии. Эксперименты на животных были выполнены с соблюдением всех соответствующих этических требований. Крысу («Шанхайский центр по исследованием лабораторных животных», Китай) трехнедельного возраста умерщвляли путем смещения шейных позвонков, помещали на 10 мин в 75%-ный спирт и затем выкладывали в большую стеклянную кювету на чисто вымытом столе. Бедренные и большие берцовые кости задних конечностей вырезали с помощью офтальмологических ножниц и москитного зажима, помещали в чашку с 75%-ным этанолом и затем дважды промывали стерильным б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.