СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2013, том 27, № 2, с. 153-159
_ СЛУХОВАЯ И ВЕСТИБУЛЯРНАЯ _
СИСТЕМЫ
УДК 576.32.36
ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГРАВИРЕЦЕПТОРНОЙ СИСТЕМЫ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ КАК ОСНОВА ДЛЯ ДОЛГОВРЕМЕННЫХ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ
© 2013 г. В. Н. Иерусалимский, П. М. Балабан
Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 117485 Москва, ул. Бутлерова, 5а E-mail ierusalimsky@yahoo.com
Поступила в редакцию 15.11.2012 г.
В работе исследована морфологическая гетерогенность первичных сенсорных нейронов органа равновесия (статоциста) виноградной улитки. Показано, что ипсилатеральный церебральный ганглий иннервирован всеми нейронами статоциста, тогда как в парный ганглий посылают свои отростки только три из них. Исследованы условия экспрессии педального пептида в нейронах статоциста. Три индивидуально идентифицируемые нейрона статоциста, содержащие педальный пептид, выявляются иммуноцитохимически в самых разных условиях, тогда как мРНК, кодирующая педальный пептид, детектируется в них преимущественно в условиях длительного воздействия микрогравитации (полет на орбитальной космической станции "Фотон-М3"). Предполагается, что мозаичное строение статоциста может являться основой для избирательных реакций животного на изменения положения его тела в пространстве.
Ключевые слова: статоцист, улитка, нейроны, иммуноцитохимия, педальный пептид.
ВВЕДЕНИЕ
Моллюски обладают зрением, тактильным восприятием, хеморецептивным чувством (вкус и обоняние), гравирецепцией. Большую часть информации о внешнем мире они получают через хеморецептивное чувство, тактильное восприятие и через гравирецепцию. В работе R. Chase (Chase, 2002) суммированы данные многолетних работ на наземных моллюсках, в том числе об участии сенсорных систем в их поведении. Система гра-вирецепции состоит из двух парных статоцистов, расположенных в оболочках педальных ганглиев, и каждый из них соединен с ипсилатеральным церебральным ганглием нервом статоциста. Внутри каждого статоциста расположено от 10 до 13 нейронов (Ковалев и др., 1981; Зайцева, 1992), каждый из которых посылает один отросток в нерв статоциста. Нейроны плоские, а соединяясь по периметру, покрывают всю поверхность ста-тоциста - это напоминает строение футбольного мяча. Своими рецепторными выростами нейроны
статоциста контактируют с известковыми камешками, заполняющими полость статоциста - стато-кониями (Ковалев и др., 1981; Зайцева, 1992). То, что нейроны покрывают всю поверхность статоциста, дает животному возможность реагировать на изменения в положении тела относительно поверхности земли.
Морфологически система ветвления волокон нейронов статоциста была описана на виноградной улитке ранее (Овчинников, 1986). Оказалось, что волокна нейронов статоциста, входя в церебральный ганглий в его метацеребральной части, ветвятся, образуя густое и плотное скопление волокон. От этой области ветвления отходит нервный тракт в церебропедальную коннективу и пучок волокон, идущий в парный (контрлатеральный) церебральный ганглий. Там эти волокна формируют область ветвления в метацеребраль-ной части ганглия и посылают тракт к началу церебропедальной коннективы. Несмотря на внешнюю униформность строения нейронов ста-тоциста, они сильно различаются между собой по
154
ИЕPУCАЛИMCKИЙ, БАЛАБАH
химической природе. В работе, выполненной на статоцистах морского моллюска Pleurobranchaea (Ohsuga et al., 2000), было показано, что стато-цист состоит из 13 нейронов разной химической природы. Две клетки содержали нейропептид SCPB, три - нейропептид FMRFamid, а восемь других клеток - гистамин. Расположение клеток, содержащих тот или иной медиатор, было повторяющимся от препарата к препарату. В статоци-сте улитки Helix были выявлены три нейрона, содержащих педальный пептид (Poteryaev et al., 1997), химическая природа остальных нейронов статоциста виноградной улитки неизвестна.
Группа нейропептидов - педальные пептиды -были идентифицированы у морских моллюсков Aplysia и Tritonia (Pearson, Lloyd, 1989; Lloyd, Connolly, 1989; Lloyd et al., 1996) и у виноградной улитки Helix (Poteryaev et al., 1997; Pavlova, Willows, 2005). Показано, что педальный пептид является нейромедиатором (Pearson, Lloyd, 1989). Педальный пептид найден во многих нейронах ЦНС виноградной улитки, а также в механосен-сорных нейронах кожи и в рецепторных клетках глазных щупалец улитки (Pavlova, Willows, 2005).
Задача настоящей работы - выяснить одинаковы ли все нейроны статоциста по типу своего ветвления и проекций, и могут ли нейроны ста-тоциста реагировать избирательно (в силу их гетерохимизма) на условия космического полета (включающие в себя микрогравитацию).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В экспериментах с прокрасками нервной системы через нервы использовали интактных взрослых животных вида Helix aspersa. В иммуноци-тохимических опытах по выявлению нейронов, содержащих педальный пептид, и в опытах по выявлению нейронов, содержащих мРНК, кодирующую педальный пептид (in situ hybridization), использовали как интактных животных, так и животных, перенесших полет на орбитальной станции "Фотон-М3".
Космические станции серии "Фотон" поддерживают температуру внутри спутника, но не обладают приборами поддержания состава атмосферы. В силу этого возможно только 2-3-недельное пребывание на спутнике животных, требующих минимальных усилий по поддержанию условий жизни. Температуру на спутнике и в контейнере с улитками контролировали в течение полета (16-20 °C). Гравитация была минимальной
10-3—10-5 g. Продолжительность полета составляла 12 дней. Животные (20 молодых улиток вида Helix aspersa весом 1-2 гр) попали в лабораторию через 13 ч после приземления станции "Фотон-М3". Внешний контроль показал, что животные были в активном состоянии и получали необходимую пищу. Для условий космического полета были характерны различные воздействия на животных: не только микрогравитация во время полета, но и перегрузки, связанные со взлетом и посадкой спутника (порядка 5-6 g).
Прокраску нерва статоциста в ретроградном (к статоцисту) и в антероградном (к церебральному ганглию) направлениях, как и прокраску межцеребральной комиссуры, осуществляли путем всасывания кончика нерва в микропипетку, заполненную 4%-ным раствором нейробиотина (Vector Labs) в 0.1 M KCl. Через 2-3 сут (при 4 oC) препараты фиксировали в 4%-ном растворе пара-формальдегида в 0,1 M растворе фосфатного буфера, отмывали, снимали как грубые, так и тонкие оболочки и выявляли волокна и нейроны при помощи либо АВC метода, либо при помощи флюоресцентного маркера - стрептавидина, конъю-гированного с красителем Alexa 488 (Molecular Probes). Препараты заливали в Aqua Poly/Mount (Polysciences, Inc.) и фотографировали при помощи камеры AxioCam HRc (Zeiss, Germany), соединенной с микроскопом Axioskop-2 FS plus (Zeiss, Germany).
Для иммуноцитохимического исследования мы использовали как целые ЦHC животных, так и отдельно статоцисты. Препараты фиксировали в 4%-ном растворе параформальдегида в фосфатном буфере, отмывали, очищали от оболочек и инкубировали в растворе первичного, а затем вторичного антител, разведенных в блокирующем растворе. ^став блокирующего раствора: 0.5%-ный Triton X-100, 0.01%-ный азид натрия, 5%-ная нормальная козья сыворотка (Sigma), 1%-ный БCА (бычий сывороточный альбумин, Sigma) в 0.1 M растворе фосфатного буфера. Время инкубации в первичном антителе при разведении 1:100 (Willows et al., 1997) составляло 48-72 ч при 4 °C, во вторичном антителе (козье-антикроличье, конъюгированное с флюоресцентным красителем Alexa 488, 1:100, Molecular Probes, Caltag Laboratories) - 24 ч.
Метод in situ hybridization был использован для выявления мPHK, кодирующей педальный пептид (белок-предшественник помещен в базу данных -Accession Number: U62544). Зонд (антисенс), меченный дигоксигенином, был синтезирован сотрудником Института молекулярной биологии
им. Энгельгардта Д.А. Потеряевым (Poteryaev et al., 1997). мРНК выявляли у интактных животных (11 улиток) и у животных через 14 ч после приземления спутника (16 улиток). Животных анестезировали инъекцией изотонического раствора MgCl2 (15% от веса тела). После двухчасовой фиксации ЦНС в 4%-ном растворе ПФС при комнатной температуре препараты обрабатывали в соответствии с ранее описанной методикой для проведения гибридизации на препаратах целой ЦНС (Balaban et al., 2001)
РЕЗУЛЬТАТЫ
В первой части работы мы исследовали проекции нейронов статоциста. При антероградной прокраске нерва статоциста (в направлении церебрального ганглия) выявили тип ветвления, ранее описанный в работе Овчинникова (Овчинников, 1986): две области ветвления в метаце-ребральной части церебральных ганглиев и тракты, идущие от этих зон ветвления к основанию церебропедальной коннективы (рис. 1, а, б, в; рис. 2). Нам не удалось проследить дальнейший путь этого тракта, возможно, он заканчивается в основании коннективы. Область ветвления в средней части церебральных ганглиев (рис. 1, в) была исключительно плотной, с многочисленными варикозностями, что предполагает наличие в ней синаптических контактов. В наших опытах, при прокраске нерва статоциста, никогда не выявлялись тела нейронов в церебральных ганглиях, т.е. все волокна в этом нерве принадлежали нейронам статоциста. Таким образом, нейроны, которые могли бы давать проекции в орган равновесия, не были выявлены.
На срезе нерва статоциста можно видеть около 18-20 волокон (рис. 1, г), что превышает общее число нейронов в этом органе (13). Видимо, это объясняется ветвлением нейритов (Зайцева, 1992). При прокраске нерва в направлении стато-циста окрашивались все нейроны (рис. 1, д).
С целью выяснить, какие из нейронов посылают свои отростки в контрлатеральный церебральный ганглий, мы перерезали межцеребральную коннективу и ретроградно окрашивали стато-цист. При этом выявлялись только три нейрона (рис. 1, е): один у основания нерва статоциста и еще два, лежащие более глубоко. Таким образом, в ипсилатеральный церебральный ганглий посылают свои отростки все нейроны статоциста, а в контрлатеральный церебральн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.