УДК 576.32/.36;57.085.23;57.053.2;577.352.465
ГЕТЕРОГЕННОСТЬ МЕХАНИЗМОВ КАЛЬЦИЕВОГО ОТВЕТА НА КАИНАТ И ТИПЫ НЕЙРОНОВ В ПЕРВИЧНОЙ КУЛЬТУРЕ КОРЫ ГОЛОВНОГО
МОЗГА КРЫС
© 2011 г. П. А. Абушик, А. Е. Большаков, Д. А. Сибаров, С. М. Антонов
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, пр. Тореза, д. 44, Санкт-Петербург, 194223; факс: (812) 552-3012; электронная почта: antonov@iephb.ru
Поступила в редакцию 28.05.2010 г.
На первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс изучали динамику внутриклеточного Са2+-сигнала, вызываемого N-метил-^-аспартатом (NMDA, 30 мкМ) и каинатом (KA, 30 мкМ), ее зависимость от внеклеточного Са2+ и механизмы, обеспечивающие вход Са2+ в нейроны при действии КА. [Са2+] i измеряли на конфокальном микроскопе Leica SP5 MF при помощи флуоресцентного индикатора Са2+ Fluo-3, позволяющего регистрировать изменения [Са2+](- в микромолярном диапазоне концентраций. Динамика увеличения [Са2+](- в ответ на аппликации NMDA и KA различалась, но в обоих случаях рост [Са2+](- требовал присутствия Са2+ в физиологическом растворе. Обнаружена гетерогенность популяции нейронов при действии КА на фоне блокирования кальциевых каналов L-типа нифедипином (3 мкМ) или с использованием ИЭМ-1460 (3 мкМ), блокирующего Са2+-проницаемые AMPAR (а-амино-3-(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-ил)пропионатные рецепторы), в структуру которых не входит субъединица GluR2. В экспериментах выделены три основных типа кальциевого ответа: характерного для вставочных нейронов (экспрессирующих Са2+-проницаемые AMPAR), пирамидных нейронов (с AMPAR, содержащими субъединицу GluR2, определяющую отсутствие проводимости каналов для Са2+) и нейронов промежуточного типа, имеющих оба типа AMPAR. Таким образом, показано участие кальций-проницаемых AMPAR и кальциевых каналов L-типа в обеспечении входа Са2+ в нейроны при действии КА, и выявлены различия в динамике изменения [Са2+] i в ответ на аппликацию KA, зависящие от субъединичного состава экспрессированных AMPAR. Результаты экспериментов показывают, что в первичной культуре ткани присутствуют морфофункциональные типы нейронов, характерные для коры взрослых животных.
Ключевые слова: каинат, внутриклеточный кальций, нейроны, ионные каналы, рецепторы глутамата.
Ионотропные рецепторы глутамата (GluR) центральной нервной системы позвоночных и человека [1] — основной предмет обсуждения, когда речь идет об "эксайтотоксичности" или о нейро-токсическом действии глутамата (Glu) [2—4], которое проявляется при накоплении возбуждающего нейромедиатора в межклеточном пространстве за счет секреции из нейронов и глиальных клеток [5—7]. Гиперактивация GluR сопровождается нейродегенерацией, которая развивается как посредством некроза, так и апоптоза [2, 8—10], и вовлечена в патогенез многих нейродегенератив-ных заболеваний, инсульта, двигательных расстройств и т.д. [3, 11, 12].
В настоящее время сформировались представления о том, что нейротоксическое действие Glu реализуется через GluR, в основном NMDA (N-метил-^О-аспартат, NMDAR)-rarn, канал которых обладает высокой проводимостью для Ca2+ [13]. Аппликация Glu или NMDA к первичной культуре нейронов приводит к резкому повыше-
нию концентрации свободного Са2+, входящего в нейроны из внеклеточного раствора через каналы ММЭАЯ. Со временем это повышение сопровождается отсроченной Са2+ дисрегуляцией (ОКД) — лавинообразным увеличением концентрации внутриклеточного Са2+ до микромолярных значений [14]. Считается, что ОКД развивается в результате митохондриальной дисфункции и выхода Са2+ из внутриклеточных депо [15, 16] и является этапом запуска необратимых процессов гибели нейронов [4].
Хотя значение ММЭАЯ для "эксайтотоксичности" трудно переоценить, известно, что каинат (КА) — избирательный агонист АМРА (а-амино-3-(3-гидрокси-5-метилизоксазол-4-ил)пропио-нат, АМРАЯ) типа С1иЯ, который, активируя рецепторы, не вызывает их десенситизации [17], способен так же, как и ММЭА, вызывать нейро-дегенерацию, индуцируя развитие некроза и апоптоза [8—10]. Несмотря на то, что каналы АМРАЯ в целом хуже проницаемы для Са2+, чем ММЭАЯ
[1, 13], КА вызывает увеличение частоты внутриклеточных осцилляций Са2+ и Са2+-дисрегуля-цию в нейронах различной структурной принадлежности [18, 19].
В данной работе, выполненной на первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс, сопоставляется динамика внутриклеточного Са2+-сиг-нала, вызываемого NMDA и KA, его зависимость от внеклеточного Са2+. С использованием фармакологического подхода анализируются механизмы повышения внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са2+] ¡) и природа ионных каналов, обеспечивающих вход Са2+ в условиях длительной активации AMPAR. Нами показано участие кальций-проницаемых AMPAR и кальциевых каналов L-типа в обеспечении входа Са2+ в нейроны при действии КА. По индивидуальным особенностям экспрессии AMPAR различного субъединичного состава и по характеру воздействия фармакологических агентов на внутриклеточный Са2+-сигнал можно выделить три основных группы нейронов, соответствующих пирамидным нейронам, вставочным нейронам и нейронам промежуточного типа.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на первичной культуре нейронов коры большого мозга крыс линии Вистар при температуре 23—26°С. Методика приготовления культуры нейронов детально описана ранее [8, 20]. Для получения культуры использовали эмбрионы на 16-й день пренатального развития (Е16). Кору головного мозга эмбрионов выделяли при низких температурах. Стеклянную чашку Петри с физиологическим раствором, в которой осуществляли препарирование, ставили на чашку Петри с сухим льдом. Клетки культивировали в питательной среде на стеклах, предварительно обработанных поли-^-лизином.
Опыты проводили на нейронах, находящихся 7—10 дней in vitro (DIV). В опытах использовали физиологический раствор следующего состава (концентрации указаны в мМ): №С1, 140; КС1, 2.8; СаС12, 1.0; MgSO4, 1.0; HEPES 10, при pH 7.2— 7.4. Поскольку внеклеточный Mg2+, блокируя каналы NMDAR [21], оказывает нейропротектор-ное действие на нейроны 7-10 DIV [22], в опытах c NMDA использовали физиологический раствор, не содержащий Mg2+. При аппликации NMDA всегда добавляли 30 мкМ глицина — коагониста NMDAR [23]. Для замены растворов на бескальциевый и/или содержащий 30 мкМ NMDA, 30 мкМ КА, 3 мкМ нифедипин и 3 мкМ ИЭМ-1460 (IEM-1460) использовали систему перфузии. Нейроны непрерывно перфузировали физиологическим раствором со скоростью 2 мл/мин. Объем ванночки составлял 0.5 мл. [Са2+] i измеряли с помощью флуоресцентного Са2+-индикатора Fluo-3, позволяющего реги-
стрировать изменения [Ca2+]l в микромолярном диапазоне концентраций. Индикатор вводили в клетки в форме ацетоксиметилового эфира (Fluo-З АМ, MoBiTec, Германия; 4 мкМ, 40 мин, в темноте, 2З—25°С), смешанного с неионным детергентом Pluronic F-127 (0.02%, Molecular Probes, США). Затем клетки инкубировали в темноте в течение З0 мин в физиологическом растворе для деэтерификации и появления внутри нейронов не проникающего через мембрану Fluo-З. Флуоресцентное изображение регистрировали при помощи конфокального сканирующего инвертированного микроскопа Leica SP5 MF (Leica Microsystems, Германия) на протяжении всего опыта (60—90 мин) с интервалом 1 мин. Пример изображения приведен на рис. la. Возбуждение флуорохрома (Fluo-З) осуществляли светом аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Эмиссию регистрировали в спектральном диапазоне 500— 580 нм. С использованием программного обеспечения Leica LAS AF (Leica Microsystems, Германия) строили графики зависимости интенсивности свечения отвечающих на воздействие клеток от времени (рис. 1б,в).
Все среды для приготовления культур ткани приобретены в фирме Биолот, Россия; остальные использованные вещества, фирмы-производители которых не указаны выше, — в Sigma-Aldrich, США. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ MS Excel, Origin 6.1 и SigmaPlot 8.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. la приведено флуоресцентное изображение культуры нейронов коры, зарегистрированное на пике свечения. Максимальная интенсивность свечения могла быть достигнута как при действии З0 мкМ NMDA (рис. 1б), так и З0 мкМ KA (рис. 1в), хотя динамика нарастания интенсивности флуоресценции у этих агонистов существенно различалась (рис. 1г). При аппликации NMDA нейроны отвечали резким повышением [Ca2+]i, которая оставалась на стационарном уровне (рис. 1б). В отличие от NMDA в присутствии КА динамика роста [Ca2+]l значительно варьировала: в отдельных нейронах наблюдалось резкое повышение, сходное по кинетике с NMDA, а в большинстве нейронов происходило медленное нарастание флуоресценции, достигавшее максимума после З0 мин воздействия КА (рис. 1в). Средние данные для NMDA и KA сопоставлены на рис. 1г. Очевидно, что внутриклеточный Ca2+-сигнал при активации AMPAR развивается медленно, но через ~З0 мин флуоресценция достигает средней величины, полученной при активации NMDAR. После 40 мин воздействия увеличение интенсивности свечения для обоих агонистов Glu достигает насыщения. Это может быть свидетель-
et'' У " •
л- ч'Ч (Ç
w т. щ, *
1 0 \ » * *
к lé Vi ' 4 *
100 мкм ■■ 1
3 -
2 -
20
40 мин
20
40 мин
Интенсивность 2.2 г
г
♦ NMDA О KA
10
20
30
40
50
60
мин
Рис. 1. Сопоставление динамики внутриклеточных Са2+-ответов нейронов коры большого мозга крыс в первичной культуре ткани на длительную аппликацию NMDA (30 мкМ) и КА (30 мкМ). а — Флуоресцентное изображение культуры нейронов коры, зарегистрированное на пике свечения, после 39 мин воздействия 30 мкМ КА. б — Динамика увеличения [Са2+], в нейронах при действии 30 мкМ NMDA (момент аппликации NMDA показан пунктирной линией). Ось ординат — относительная интенсивность свечения (за 1 принято свечение в контроле — физиологическом раство-
ре). в — Динамика увеличения [Са2+], в нейронах при действии 30 мкМ КА (момент аппликации КА показан пунктирной линией). г — Сопоставление динамики Са2+-сигнала на NMDA и КА. Представлены средние ± стандартные ошибки для NMDA из пяти опытов (общее число нейронов — 48), для KA из пяти опытов (общее
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.