КОЛЛОИДНЫЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 76, № 5, с. 659-672
УДК 544.77+546.92+57.085.2
ГЕТЕРОКОАГУЛЯЦИЯ КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКА С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ПОЛИСАХАРИДАМИ НАНОЧАСТИЦАМИ ПЛАТИНЫ © 2014 г. В. Р. Эстрела-Льопис*, А. В. Чевычалова*, Н. А. Тригубова**, Е. В. Рыжук*
*Институт биоколлоидной химии им. Ф.Д. Овчаренко Национальной академии наук Украины
03044 Киев, проспект Вернадского, 42 **Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого Национальной академии наук Украины 03022 Киев, Васильковская ул., 45 E-mail: victorio.estrela@gmail.com Поступила в редакцию 05.12.2013 г.
Синтезированы наночастицы платины с адсорбционным слоем полисахаридов Chlorella vulgaris (Ptnc), и исследована их гетерокоагуляция с клетками рака яичника человека линии А2780. Показано, что характерное время агрегации клеток с наночастицами Ptnc составляет 20—25 мин, что соответствует быстрой безбарьерной коагуляции. За это время цитотоксический эффект наночастиц Ptnc достигает насыщения и при этом погибает более 50% клеток. Цитоморфологическими исследованиями установлено, что клетки А2780 с двукратно повышенной резистентностью к противоопухолевому антибиотику доксорубицину более чувствительны к воздействию наночастиц Ptnc, чем нерезистентные клетки. Предложен электрокинетический тест контроля резистентности раковых клеток, основанный на определении изменения Z-потенциала наночастиц в результате адсорбции на их поверхности водорастворимых метаболитов клеток.
Б01: 10.7868/80023291214050085
ВВЕДЕНИЕ
Исследования в области применения наночастиц (НЧ) в биологии и медицине интенсивно развиваются на протяжении последних 20 лет. Этой проблеме посвящены многие работы (см. обзоры [1—15]), в основном, — в области биодетекции/биосенсорики [1—3] (здесь проявляют себя плазмонно-резонансные свойства НЧ золота и серебра [16, 17]), а также в терапии рака. В последнем случае НЧ золота [4—7] и серебра [8] и магнитные частицы [9, 18—20] применяют, в основном, как носители лекарственных препаратов [4, 5, 9—11, 14, 18—20], а также для повышения эффективности физико-терапевтических методов лечения — радио-, фотодинамической и фототермической терапии [3, 6, 7, 12, 21—23].
При этом вызывает определенное удивление крайне ограниченный круг работ, посвященный применению НЧ платины в биодиагностике и медицине. Возможно, это связано с хорошо известными побочными негативными эффектами применения (в частности, в онкотерапии) препаратов на основе органических комплексов платины, например, цисплатина. В подобных препаратах платина находится в ионной форме. В свое время
Яцимирский пришел к выводу [24], что "...испытания многочисленных соединений платины показали, что как противораковые препараты можно использовать только электронейтральные частицы (молекулы). Катионные комплексы чрезвычайно токсичны, а анионные не эффективны, возможно, из-за их высокой реакционной способности, то есть взаимодействия с многими типами белков". НЧ платины являются электронейтральной (Р0) формой металла. Разумеется, такие частицы несут на своей поверхности заряд, знак и величина которого зависят от природы адсорбированных на их поверхности веществ и свойств дисперсионной среды (состава, рН, ионной силы). Формируя на НЧ Р1 адсорбционный слой определенного состава, можно регулировать эффекты взаимодействия таких частиц с молекулами биополимеров организма. НЧ благородного металла платины не изменяются в результате таких взаимодействий, но, благодаря ее хорошо известным каталитическим свойствам, особенно в наноразмерном состоянии, такие частицы могут вносить изменения в ход базовых биохимических реакций в клетке.
В 2008 г. авторы обзора [15] отмечали практически полное отсутствие исследований по приме-
нению НЧ платины в медицине и, в частности, в терапии рака. Однако в последние годы появились работы в этой области. Так, предложена новая стратегия лечения рака, основанная на применении НЧ платины в адронной терапии [25]. Этот метод основан на применении узко сфокусированных пучков протонов и ионов углерода, действие которых приводит к многократным разрывам двойной спирали ДНК в раковых, но не в здоровых клетках. Показано, что, в отличие от металлических ионов, в НЧ платины генерируется резонансное излучение электронов, что позволяет уменьшить суммарную дозу облучения.
Известно [26], что для клеток многих форм рака характерна повышенная поверхностная концентрация (overexpression) рецепторов фолатов. В работе [26] синтезированы стабилизированные поливинилпирролидоном (ПВП) НЧ платины (PtnBn), конъюгированные с фолиевой кислотой. В опытах с клетками рака груди линии MCF7 было показано, что эти НЧ инактивируют 76% таких клеток после 72 ч контакта, тогда как в присутствии НЧ Pt, просто стабилизированных ПВП, погибает не более 20% раковых клеток. Аналогичные результаты, но в параллельных экспериментах с нормальными (МС-3Т3-Е1) и раковыми (ROS 17/2.8) клетками культуры ткани были получены в работе [27], где показано, что модификация НЧ платины фолиевой кислотой обеспечивает их селективное токсическое действие преимущественно на раковые клетки.
Токсичность квазисферических НЧ PtnBn размером 3—10 нм была изучена в ходе анализа развития эмбрионов рыбок полосатый данио (ze-brafish) [28]. Было показано, что эти НЧ замедляют развитие эмбрионов, вызывают деформации в позвоночнике и сердечные аномалии, концентрируются в мозге.
Напротив, авторы [29] показали, что НЧ PtnBn практически такого же размера (5—6 нм), но квазикубической формы полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к НЧ в методе фототермической терапии (ФТТ), — они не токсичны для раковых клеток Neuro 2A и только в режиме ФТТ убивают их в результате нагрева среды и клеток на 9°C. Этот результат был получен с применением комплекса методов: электронной микроскопии высокого разрешения (определение размера и формы НЧ), ИК-фурье-спектроскопии (анализ механизма взаимодействия ПВП и НЧ Pt), атомно-абсорб-ционной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (определение концентрации НЧ на поверхности и внутри клеток), масс-спек-трометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (установление
апоптоза как причины гибели клеток), а также 1
тестов МТТ и с трипановым синим, позволяющих контролировать выживаемость клеток.
Аналогичные данные о нетоксичности НЧ золота, стабилизированных ПВП (АиПВП), получены в работах [32—34].
Так, в работе [32] с помощью МТТ-теста показана нетоксичность по отношению к раковым клеткам почки линии HEK293 и молочной железы линии MDA-MB-231, а также устойчивость к агрегации в биологических средах НЧ АиПВП (при их концентрации по металлу 10—100 мкМ), синтезированных с применением в качестве восстановителя NaOH и стабилизатора ПВП.
Аналогичный результат был получен для НЧ Au (восстановитель — цитрат натрия, стабилизатор — ПВП) по отношению к клеткам рака почки линии MDCK и рака печени линии HepG2 в питательной среде DMEM [33]. Цитотоксичность исследовали методами, основанными на применении красителя нейтрального красного и подсчете образовавшихся колоний (время контакта клеток с НЧ — 72 ч). При этом были использованы радиоактивные НЧ золота, что позволило количественно определить долю НЧ АиПВП, поглощенных клетками. Показано, что при изменении концентрации НЧ в смеси с клетками от 10 до 400 мкМ эта величина изменяется в пределах от 0.25 до 10.46% для клеток MDCK и от 0.75 до 16.7% для клеток HepG2 (при времени контакта 24 ч). Однако токсическое действие НЧ АиПВП в этом концентрационном диапазоне не установлено.
Дендритные клетки выполняют важные имму-норегуляторные функции: контроль за диффе-ренцировкой Т-лимфоцитов, регуляцию активации и угнетения иммунного ответа. Поэтому в работе [34] исследовано цитотоксическое действие на дендритные клетки синтезированных цитрат-ным методом и стабилизированных ПВП НЧ золота размером 10 нм. Ссылаясь на данные ПЭМ, авторы утверждают, что эти частицы (Z-потенци-ал —13 мВ, рН 7.4) устойчивы в питательной среде IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media) с добавлением факторов GM-CSF, FLT-3L и IL-6 для культивирования дендритных клеток костного мозга мышей линии C57BL/6. С помощью проточной цитофлуорометрии было установлено, что НЧ АиПВП (концентрация — 0.5 мМ, время контакта — 4—48 ч) не влияют на жизнедеятельность дендритных клеток, хотя и накапливаются в них, т.е. НЧ, стабилизированные ПВП, нетоксичны. В этой работе получен интересный ре-
1 МТТ-тест [30, 31] основан на применении бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия, который вызывает выделение гранул формазана из поврежденных тестируемым препаратом клеток. Подробнее см. в разделе "МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ".
зультат — введение в систему, содержащую клетки и НЧ АиПВП, липополисахаридов, которые стимулируют активацию клеток и выделение цитоки-нов, приводит к активации апоптоза.
В работе [35] исследовано влияние синтезированных цитратным методом и стабилизированных анионным ПАВ додецилсульфатом натрия (ДСН), НЧ платины (Р^СН) на клетки рака печени линии HEPG-2 и рака груди линии MCF-7. На основе МТТ-теста установлены критические концентрации (ГС50) НЧ РДСН, при которых за определенное время контакта (в этом случае — 24 ч) погибает 50% клеток; для клеток HEPG-2 значение 1С50 = 2904 мкг/мл, для клеток MCF-7 1С50 = = 6829 мкг/мл. Эти значения 1С50 являются очень большими (сравните, например, с результатами, которые получены нами для времени контакта 1 ч, см. табл., стр. 668), что позволяет говорить о весьма низкой токсичности НЧ Р^СН.
Авторы [35] ошибочно связали устойчивость дисперсии НЧ Р^СН в питательной среде клеток DMEM (содержавшей также 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), глутамин и антибиотики) с их высоким ^-потенциалом, обусловленным адсорбцией анионного ПАВ. Дело в том, что корректные измерения ^-потенциала (применяли Zetasizer) возможны только в разбавленном электролите, а в концентрированной по электролитному составу питательной среде двойной электрический слой сжимается, что приводит к радикальному уменьшению ^-потенциала. В этом случае агрегативную устойчи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.