БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1999, том 25, № 4, с. 270-274
УДК 577.214.622
ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЛИМФОТОКСИНОВ МЫШИ В КЛЕТКАХ Escherichia coli И ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К НИМ
© 1999 г. В. Г. Коробко*@, В. Е. Бойченко«&, Д. В. Купраиг, P. JI. Турецкая8, С. А. Недоспасов§&@#
* Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва; 5 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 117984, Москва, ул. Вавилова, 32; &Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва; @Национальный институт рака США, Фредерик (Мэриленд), США
Поступила в редакцию 03.07.98 г. Принята к печати 07.08.98 г.
В клетках Е. со/г.экспрессированы гены, кодирующие фрагменты полипептидных цепей лимфоток-синов (LT) мыши: укороченный с /V-конца LTa и внеклеточный домен LT|3, с гепта- и гексагистиди-новыми эпитопами на /V-конце соответственно. Очищенные металлохелатной хроматографией ре-комбинантные белки использованы для получения поликлональных антител, специфически распознающих LT мыши.
Ключевые слова: лимфотоксин-алъфа (LTa); лгшфотоксин-бета (LT/3); антитела; рекомбинант-ные белки; экспрессия в Е. coli.
Лимфотоксин-альфа (LTa) был описан 30 лет назад [1] и после молекулярного клонирования был идентифицирован как близкий гомолог фактора некроза опухолей (TNF) [2]. У человека и мыши гены, кодирующие LTa (называемый в прошлом TNFß) и TNF (иногда называемый TNFa), расположены тандемно на небольшом расстоянии друг от друга [3, 4]. До 1993 г. LTa считался лимфоцитспецифическим аналогом TNF, который передает сигнал через два TNF-рецептора с М 55 и 75 кДа. Открытие LTß [5] и рецептора LTß [6] помогло сформулировать концепцию, согласно которой основная функция LT - органогенез лимфатических узлов, выявленная на нокаутных моделях с инактивированными генами LTa и LTß, -осуществляется мембранным LTa/LTß гетеро-тримером [7-9], причем эта функция отлична от "функций защиты организма", одним из главных медиаторов которой является TNF [10]. Несмотря на значительный прогресс в гетерологической экспрессии белков TNF и LT человека и получении поликлональных и моноклональных антител к ним, без которых было бы невозможно изуче-
Сокращения: LT - лимфотоксин; TNF - фактор некроза опухолей; hG-CSF - гранулоцитарный колониестимулиру-ющий фактор человека; IPTG - изопропилтиоф.О-галак-топиранозид.
# Автор для переписки (тел.: (095) 135-9964; e-mail: snedos@imb.imb.ac.ru).
ние биологической функции этих цитокинов, ре-комбинантные ЪТ мыши и антитела к ним до недавнего времени описаны не были.
В настоящей работе мы сделали первый шаг для получения молекулярных реагентов на мембранный комплекс LT мыши. Нами осуществлена гетерологическая экспрессия в кишечной палочке и очистка укороченного мышиного LTa и внеклеточного домена мышиного ЬТ[3 и получены первые поликлональные антитела, способные специфически узнавать LTa и ЬТ[3 мыши.
Для получения антигена мы сконструировали экспрессионную плазмиду, содержащую искусственный ген, кодирующий укороченный на 23 а.о. с УУ-конца мышиный Ша. Такой белок аналогичен по длине и гомологичен по структуре укороченному LTa человека, продуцируемому некоторыми В- и Т-клеточными линиями [11,12]. Кроме того, укороченный человеческий белок эффективно синтезируется клетками Е. соИ как растворимый цитоплазматический белок, что позволяет очищать его, используя традиционные биохимические методы [13-15]. В качестве источника гена LTa мыши использовали плазмиду ргш^Т [предоставлена В.В. Кравченко (Исследовательский институт Скрипе, Ла Хойя, США)], содержащую искусственный ген, кодирующий зрелый полноразмерный мышиный белок LTa. Этот ген был получен лигированием большей части 4-го
ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ЛИМФОТОКСИНОВ МЫШИ
Крп I
271
Clal hCi-CSF tfmdlll Ncol
Крп I
Ncol ' Ncol
С la I
лигирование Kpríl I
Ncol
дуплекс I
CGATATGATCCTTAAACCAGCTGCTCATCTGGTTGGGTAC TAT AC T AGGAATT T GGTC GAC GAGT AGAC С AAC С
дуплекс II
CGATATGAGCCACCACCATCATCATCACCACA TATACTCGGTCCTGGTAGTAGTAGTGGTGTGC
Рис. 1. Схема конструирования плазмиды ртиЬТ22, содержащей ген, кодирующий укороченный белок ЬТа мыши с гистидиновым эпитопом. Указаны сайты рестриктаз, использованные для клонирования; Ыа - ген |3-лактамазы, оп -участок начала репликации плазмидной ДНК.
экзона [16] с синтетическим дуплексом, кодирующим недостающую часть зрелого белка. Экспрессия этого гена в клетках Е. coli приводила к накоплению мышиного LTa в виде нерастворимых телец включения (В.В. Кравченко, С.А. Недоспа-сов - неопубликованные данные).
В качестве вектора для клонирования укороченного гена LTa мыши использовали плазмиду pGGF8 - продуцент рекомбинантного гранулоци-тарного колониестимулирующего фактора человека (hG-CSF) [17]. В результате трехкомпонент-ного лигирования ^/лг1-Л'со1-фрагмента плазмиды pmuLT, синтетического дуплекса I и Clal-Ncol-векторной части плазмиды (рис. 1) была получена плазмида pmuLT02, содержащая ген, кодирующий укороченный с /V-конца на 23 а.о. LTa мыши. J Три выращивании клеток Е. coli SG20050, трансформированных этой плазмидой, наблюдали образование рекомбинантного белка в виде нерастворимых агрегатов. С целью упрощения выделения рекомбинантного белка мы сконструировали плазмиду pmuLT22, содержащую ген, кодирующий укороченный LTa мыши с гептагистидино-вым эпитопом на /V-конце, клонированием синтетического олигонуклеотидного дуплекса II в плазмиду pmuLT02 по сайту dal. Плазмида pmuLT22 детерминирует эффективный конститутивный биосинтез рекомбинантного белка I_Ta-His7 под контролем тандема триптофановых промоторов и сайта инициации трансляции с энхансером гена X бактериофага Т7.
LTß в отличие от LTa является трансмембранным белком второго типа (ZV-конец находится
внутри клетки), поэтому с точки зрения получения реагентов на нативный мембранный комплекс представлялось перспективным использование в качестве антигена внеклеточного С-кон-цевого домена, синтезированного в Е. coli. Поэтому в качестве вектора для экспрессии мы использовали плазмиду pmuLTbHis, предоставленную М.Б. Алимжановым (Институт медицинской микробиологии, иммунологии и гигиены, Мюнхен, Германия), кодирующую аминокислотную последовательность 152-306 LTß мыши [18, 19] с /V-концевым гексагистидиновым эпитопом. Для этого сначала из мРНК, полученной из активированных конканавалином А спленоцитов мыши, был синтезирован с помощью RT-PCR соответствующий фрагмент кДНК LTß, который затем был клонирован в экспрессионный плазмидный вектор pQE30 (Qiagene Inc., США). В результате получили плазмиду pmuLTbHis.
Плазмида pmuLT22 обеспечивала в клетках Е. coli высокий уровень конститутивного биосинтеза рекомбинантного белка LTa-His7, тогда как в случае плазмиды pmuLTbHis высокий уровень синтеза белка LTß-His6 достигался при индукции IPTG [20]. Рекомбинантные белки LTa-His7 и LTß-His6 были очищены в одну стадию хроматографией на №2+-сефарозе. Чистота полученных таким образом препаратов рекомбинантных LTa-His7 и LTß-His6 по данным SDS-ПААГ была не менее 90% (рис. 2).
Следует отметить, что, хотя рекомбинантные белки LTa-His7 и LTß-His6 могли быть выделены в растворимой форме только в присутствии 7 М
272
КОРОБКО и др.
мочевины, они, как показали дальнейшие эксперименты, были пригодны для получения антител. Для этого их сначала высаживали этанолом, суспендировали в полном адъюванте Фрейнда и использовали для иммунизации. Сыворотки были протестированы на способность узнавать соответствующие рекомбинантные белки методом иммуноблоттинга. Оказалось, что антитела к внеклеточному домену LTß эффективно узнают рекомбинантный LTß-His6, не реагируют с полноразмерным LTa и TNF мыши (данные не представлены) и показывают очень слабую перекрестную реакцию с укороченным LTa-His7. Соответственно антитела к LT«-His7 эффективно узнают этот белок в иммуноблоттинге и не взаимодействуют с LTß-Hi,s6 мыши (рис. 3).
Таким образом, нами получены специфические иммунологические реагенты на LTa и LTß мыши, которые являются кандидатами на узнавание нативного мембранного LT-комплекса. В дальнейшем мы планируем использовать эти антитела для детекции лимфотоксинов мыши.
Рис. 2. Электрофорез в 13% SDS-ПААГ лизатов клеток Е. coli M 15 [pRep4], трансформированных плаз-мидой pmuLT22 (/) и клеток Е. coli SG20050, трансформированных плазмидой pmuLTbHis (2), а также препаратов рекомбинантных белков LTa-His7 (3) и LTß-His6 (4), очищенных металлохелатной хроматографией.
(я) (б)
кДа 12 3 4 83-
62-47.5-
32.5-
LTß-His6 LTa-His7
Рис. 3. Иммуноблоттинг с антителами к LTß-His6 (а) и LTa-His7 (б) лизатов клеток Е. coli Ml5 [pRep4], трансформированных плазмидой pmuLT22 (/, 3) и клеток Е. coli SG20050, трансформированных плазмидой pmuLTbHis (2, 4). Указано положение белков-маркеров молекулярной массы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали следующие материалы и реагенты: акриламид, бисакриламид, меркапто-этанол, персульфат аммония, трис-гидроксиме-тиламинометан (Трис), Л^,ЛГ,Л/'-тетраметилэти-лендиамин (Merck, Германия); глицерин, додецил-сульфат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту, борную кислоту (Serva, Германия); трип-тон, дрожжевой экстракт, агар (Difco, Англия); агарозу (FMC, США); эндонуклеазы рестрикции Kpnl, Ncol, Clal, а также ДНК-полимеразу из Thermus aquaticus и ДНК-лигазу фага Т4 производства Life-Biotechnologies (США). Использовали штаммы Е. coli Ml5 [pREP4] recA+ (F", lac, arcr, gat, mtl~, uvrA+, Nals, Strs, ril5) фирмы Qiagene Inc. (США) и E. coli SG20050 reck [F", araD139, A(argF-lac) U169,//№5301, deoC 1, rçwL150, re/Al, Д/о/г-100, c.s/?-50::Mu dl] [21]. Приготовление компетентных клеток, трансформацию бактерий, выделение плазмидной ДНК, ферментативную обработку, электрофорез ДНК и белка, выделение РНК и иммуноблоттинг проводили по стандартным методикам [22]. Строение полученных плазмид подтверждали определением нуклеотид-ной последовательности участков ДНК с использованием набора для определения нуклеотидной последовательности фирмы USB (США). Для им-мунодетекции использовали систему ECL (Amer-sham, Англия).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.