научная статья по теме ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ПОТОКА И ТУБУЛИНОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ МЕЖДОУЗЛИЯ ELODEA DENSA Биология

Текст научной статьи на тему «ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ПОТОКА И ТУБУЛИНОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ МЕЖДОУЗЛИЯ ELODEA DENSA»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2010, том 57, № 3, с. 478-480

КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ

УДК 581.1

ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ПОТОКА И ТУБУЛИНОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦИТОСКЕЛЕТА В КЛЕТКАХ МЕЖДОУЗЛИЯ Elodea densa © 2010 г. В. Н. Воробьев, А. В. Анисимов

Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра

РАН, Казань Поступила в редакцию 23.01.2009 г.

Для исследования гидродинамических показателей цитоплазматического потока методом спин-эхо ЯМР изучали трансляционную диффузию воды цитоплазмы в клетках стебля элодеи (Elodea densa (Planch.) Casp.), измененную действием антимитотических препаратов. Под влиянием колхицина динамика трансляционного смещения имела вид кривой с экстремумом в первые часы наблюдения. Действие винбластина выражалось в монотонном снижении трансляционной диффузии. Суточное воздействие колхицина или винбластина приводило к снижению трансляционной диффузии. Все различия в действии использованных препаратов фиксировали на фоне отсутствия изменений в скорости цитоплазматического потока.

Ключевые слова: Elodea densa — цитоскелет — диффузия — ЯМР

ВВЕДЕНИЕ

Важнейшим показателем функционирования растительной клетки является цитоплазматиче-ский транспорт, который осуществляется при помощи специализированных механохимических АТФаз, называемых моторными белками [1]. Интенсивность транспортного потока регулируется как взаимным влиянием тубулинового и актино-вого компонентов цитоскелета, так и активностью моторных белков [2—4]. Особенность транспортных процессов в цитоплазме растительной клетки такова, что формируемый цитоплазмати-ческий поток не обеспечивает интенсивного перемешивания, поскольку в биоколлоиде с низким числом Рейнольдса, каковым является цитоплазма, сильны межмолекулярные взаимодействия [5]. Эффективность перемешивания зависит от гидродинамических параметров цитоплазмы, которые связаны с диффузией воды и растворенных в ней веществ. Именно диффузия обеспечивает реагентами реакционные объемы субклеточных компартментов [6]. К одному из вероятных механизмов регуляции клеткой гидродинамических параметров ее цитоплазмы можно отнести степень структурированности цитоскелета, напри-

Сокращения: ДЗ — диффузионное затухание; Б* — коэффициент диффузии воды цитоплазмы, измененный цитоплаз-матическим течением.

Адрес для корреспонденции: Воробьев Владимир Николаевич. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31. Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН. Электронная почта: vorobyev@mail.knc.ru

мер, отношение свободного тубулина к тубулину микротрубочек.

В настоящей работе исследовали зависимость трансляционной диффузии воды цитоплазмы в цитоплазматическом потоке от целостности мик-ротрубочкового цитоскелета, который модифицировался винбластином или колхицином.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Строение стебля элодеи (Elodea densa (Planch.) Casp.) позволяет определять параметры цито-плазматического потока параллельно как методом синхронного сопровождения с использованием микроскопии [7], так и спин-эхо методом ЯМР с использованием техники селективной регистрации диффузионного переноса только по цитоплазме [8].

Приготовление образцов. После удаления листьев стебель нарезали на сегменты до 1 см, которые инфильтрировали в растворах колхицина или винбластина в концентрации 1 мМ при давлении 10 Па в течение 60 мин. После проведения измерений сегменты помещали в исходный раствор, в котором экспонировали при нормальных условиях. Жизнеспособность клетки определяли по наличию цитоплазматического потока.

Визуальная оценка цитоплазматических течений.

На продольном срезе междоузлия в неповрежденных клетках, средний размер которых превышал 500 мкм, методом синхронного сопровождения [7] определяли скорость цитоплазматического тече-

ГИДРОДИНАМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ПОТОКА 479

ния. Суть метода заключалась в наложении на изображение клетки в поле зрения микроскопа метки в виде светящейся точки. Скорость движения точки синхронизировали со скоростью движущихся ци-топлазматических включений. В качестве метки использовали луч с экрана осциллографа, который с помощью рисовального аппарата, закрепленного на микроскопе, заводили в окуляр. Скорость движения луча задавали генератором пилообразного напряжения. Время прохождения лучом определенного расстояния фиксировали частотомером, а затем с учетом увеличения микроскопа рассчитывали скорость движения. Измерения проводили при комнатной температуре. Значения скоростей определяли до инфильтрации, сразу после инфильтрации и через 24 ч перед последними ЯМР-измерени-ями.

Метод ЯМР. Эксперименты проводили на оригинальном спин-эхо ЯМР-релаксометре-диффузометре на частоте 16 МГц с использованием техники импульсного градиента магнитного поля [9]. В качестве базовой использовали импульсную последовательность стимулированного эха [10]. Получаемое диффузионное затухание эха (ДЗ) описывается выражением:

R = exp[-YW(id - 1/35)D], (1)

где у — гиромагнитное отношение, D — коэффициент самодиффузии, 5 и g — величина и длительность импульсов градиента магнитного поля соответственно, td — интервал между ними — время диффузии, R — относительная амплитуда эха, равная A(g)/A(0). Импульсный градиент магнитного поля создавали в аксиальном направлении стебля. ДЗ получали в условиях изменения величины g (32 шага с максимумом при 4.2 Т/м) при фиксированных параметрах 5 = 250 мкс и времени диффузии td = 15 мс.

Для подавления сигнала от воды вакуоли перед диффузионными измерениями включали инвертирующий 180° радиочастотный импульс в момент времени релаксационного перехода намагниченности от воды вакуоли через нуль (нулевой момент) [8, 11].

Для создания и поддержания температуры (21—22°С) была использована жидкостная схема термостатирования с точностью поддержания температуры образца в датчике ЯМР-релаксомет-ра-диффузометра выше 1°С.

Обработка результатов. В оригинальном спин-эхо ЯМР-релаксометре-диффузометре значение фактора R варьирует в зависимости от отношения сигнал/шум в диапазоне до 10%, но усредняется по нескольким измерениям аппроксимирующей экспонентой так, что точность определения коэффициентов диффузии лучше 5%. Представлены средние арифметические коэффициентов диффузии из 3 независимых экспериментов, каждый из которых проведен в 3-кратной биологиче-

S S

£

-е s

4 н я о

5

я я -е -е

m о

3.5

3.0

2.5

q 2.0

1.5

5 10 15 20 Время экспозиции, ч

25

Зависимость коэффициента диффузии воды цитоплазмы (В*) от времени экспозиции предварительно инфильтрированных при давлении 10 Па в течение 60 мин междоузлий в дистиллированной воде (1); 1 мМ растворе колхицина (2) или 1 мМ растворе вин-бластина (3).

скои повторности, и их стандартные отклонения. Скорости движения цитоплазмы из 9 независимых экспериментов даны как средние арифметические и их стандартные отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В экспериментах скорость цитоплазматических течении под действием винбластина или колхицина изменилась незначительно: в контрольных образцах скорость движения цитоплазмы составляла 17 ± 2 мкм/с, а в опытных — 18 ± 1.5 мкм/с, что указывает на сохранение функционирования акто-миозинового мотора. При этом изменение коэффициентов диффузии воды цитоплазмы было различно (рис. 1).

После инфильтрации контрольного образца в дистиллированной воде коэффициент диффузии воды цитоплазмы (В*), измененный цитоплазма-тическим течением, незначительно увеличивался (рис. 1, кривая 1). Инфильтрация образца в растворе винбластина (кривая 3) приводила к монотонному снижению В*. Под влиянием колхицина динамика В* имела вид кривой с экстремумом в первые часы наблюдения (кривая 2).

Винкаалкалоиды, к которым относится вин-бластин, подавляют полимеризацию микротрубочек, связываясь с тубулином как на "+", так и на "—" концах. Кроме того, они ингибируют гидролиз ГТФ, связанной с р-тубулином [12]. Как следствие, концентрация немикротрубочкового тубулина в цитоплазме возрастает, что приводит к снижению В* (рис. 1, кривая 3).

0

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ том 57 № 3 2010

480

ВОРОБЬЕВ, АНИСИМОВ

Действие колхицина на микротрубочки выражается в повышении нуклеозидтрифосфатной активности тубулина. Комплекс этого соединения с тубулином принимает участие в нуклеации микротрубочек, т.е. в образовании "затравки", с которой начинается рост. В результате концентрация колхицин-связанных димеров тубулина в цитоплазме возрастает, а концентрация свободного тубулина снижается, что находит отражение в сложном поведении зависимости D* от времени (рис. 1, кривая 2), по крайней мере, в первые часы наблюдения. Присоединение колхицин-активи-руемой "затравки" к "+"-концу микротрубочки блокирует полимеризацию этого конца [13, с. 73], а последующая деструкция микротрубочек повышает концентрацию димеров тубулина в цитоплазме.

В целом, за время наблюдения влияние колхицина или винбластина приводило к снижению D* на 0.3 х 10-9 и 0.5 х 10-9 м2/с соответственно. Проведенные исследования показали, что параметры трансляционной диффузии воды цитоплазмы зависят не только от скорости цитоплазматическо-го потока, но и от структурной организации тубу-линового компонента цитоскелета.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-01258-а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Минин А.А., Кулик А.В. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции // Успехи биол. химии. 2004. Т. 44. С. 225-262.

2. Kobayashi H., Fukuda H., Shibaoka H. Interrelation between the Spatial Disposition of Actin Filaments and Microtubules during the Differentiation of Tracheary Elements in Cultured Zinnia Cells // Protoplasma. 1988. V. 143. P. 29-37.

3. Takesue K., Shibaoka H. The Cyclic Reorientation of Cortical Microtubules in Epidermal Cells of Azuki Bean Epicotyls: The Role of Actin Filaments in the Progression of the Cycle // Planta. 1998. V 205. P. 539-546.

4. Hasezawa S., Sano T., Nagata T. The Role of Microfilaments in the Organization and Orientation of Micro-tubules during the Cell Cycle Transition from M Pha

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком