ПАРАЗИТОЛОГИЯ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 597.556.3:577.15
ГИДРОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ СИМБИОНТНОЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА ЩУКИ (Esox lucius L.)
© 2011 г. Г. И. Извекова*, А. О. Плотников**
*Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузский р-н, e-mail: izvekov@ibiw.yaroslavl.ru **Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, 460000 Оренбург, ул. Пионерская, д. 11 Поступила в редакцию 08.04.2009 г.
Установлено существование микрофлоры, с различной степенью прочности ассоциированной со слизистой кишечника щуки. Выделено 82 штамма бактерий. Обнаруженные микроорганизмы продуцируют ферменты, гидролизующие основные пищевые субстраты: белки и углеводы. Указанные ферменты вырабатываются как совокупностью различных микроорганизмов, обитающих в кишечнике, так и отдельными штаммами, выделенными в чистой культуре. Обнаруженные штаммы продуцируют ферменты с различными уровнями активности. Большинство выделенных штаммов (68%) продуцируют проте-азы. Вычисленный коэффициент К/П (отношение активности карбогидраз к активности протеаз) косвенно свидетельствует об автохтонности микрофлоры, ассоциированной со слизистой кишечника щуки. По-видимому, ферменты микрофлоры вносят существенный вклад в гидролитическую активность кишечника щуки, однако оценка этого вклада затруднительна.
Ключевые слова: кишечник рыб, микрофлора, ферментативная активность.
ВВЕДЕНИЕ
Существует обширная литература по количественному и качественному составу энтеральной микрофлоры позвоночных животных, в частности рыб [5, 14—16]. При этом большинство работ касаются разводимых в прудовых хозяйствах видов [12, 14]. Значительно меньше исследований по изучению функций микрофлоры в кишечнике рыб. Для высших позвоночных животных установлено, что микроорганизмы, заселяющие кишечник, обладают набором специфических ферментов, позволяющих гидролизовать субстраты, недоступные ферментам макроорганизма. Участие ферментов микрофлоры в процессах пищеварения снижает энергетические и пластические затраты организма на синтез собственных пищеварительных гид-ролаз [7].
Для трех видов растительноядных морских рыб (Kyphosus sydneyanus (Günther), Aplodactylus arctidens Richardson и Odax pullus (Forster)) показано, что амилолитическая активность, связанная с клеточными экстрактами микроорганизмов, прогрессивно повышается от передних отделов кишечника к задним, в отдельных случаях достигая 1/3 общей активности [21]. Ферменты микроорганизмов вносят существенный вклад в ферментативную активность и снабжение хозяина энергией [21]. Из кишечников девяти видов рыб выделена микрофлора, обладаю-
щая амилолитической, целлюлозолитической, ли-политической и протеолитической ферментативной активностями [13]. Исследования показывают, что микроорганизмы положительно влияют на пищеварительные процессы рыб. Можно утверждать, что некоторые ферменты, активность которых обнаружена в желудочно-кишечном тракте камбалы, могут быть микробиального происхождения. В частности, важные для питания камбалы карбогид-разы, хитиназа, хитобиаза, протеазы, коллагеназа и эластаза могут иметь бактериальное происхождение [19]. Из кишечника молоди роху (Labeo rohita (Hamilton)) выделено три типа кишечных бактерий. Бактерии в культуре способны к продуцированию внеклеточных протеазы, амилазы и целлюлазы, что может играть важную роль в пищеварении у личинок роху [18].
Выявлена способность микроорганизмов, выделенных из содержимого кишечника щуки (Esox lucius L.), леща (Abramis brama (L.)), плотвы (Rutilus rutilus (L.)) и окуня (Perca fluviatilis L.), продуцировать амилолитические и протеолитические ферменты [4]. При этом уровень активности протеиназ микроорганизмов, выделенных из кишечников рыб, зависит от температуры, рН и состава среды культивирования.
В большинстве указанных работ исследована микрофлора содержимого кишечника, в то время как роль микроорганизмов, колонизирующих сли-
зистую поверхность кишечника, остается недоучтенной.
Цель работы — исследование способности бактерий, ассоциированных со слизистой кишечника щуки, синтезировать протеолитические и амилоли-тические ферменты и определение их возможной роли в пищеварении хозяина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служила слизистая оболочка кишечника щуки (Едах Шаш Ь.) Рыбинского водохранилища. Для стерилизации поверхности кишечник промывали спиртом, затем вскрывали в стерильных условиях. Смывы с кишечника щуки получали, используя модификацию метода последовательной десорбции ферментов с отрезков кишки [3]. Для этого отрезки кишечника помещали в колбу со стерильным раствором Рингера (10 мл) для холоднокровных животных (рН 7.4) и встряхивали. Затем в стерильных условиях эти отрезки последовательно переносили в другие колбы с раствором Рингера и повторяли встряхивание, получая разные фракции, содержащие ферменты и микроорганизмы, которые в зависимости от прочности фиксации постепенно смываются с поверхности слизистой. Первую фракцию Д1 получали после 30-секундного встряхивания, остальные Д2—Д5 — через каждые последующие 15 мин. Для микробиологических исследований использовали фракции Д1, Д3, Д5. В ряду Д1—Д5, т.е. по мере приближения к поверхности, прочность ассоциации бактерий с пищевари-тельно-транспортными поверхностями возрастает, а полученные фракции соответствуют распределению микрофлоры в кишечнике — от полостной микрофлоры во фракциях Д1—Д2 до глубинной (пристеночной) во фракциях Д3—Д5. Гомогенат (Г) слизистой оболочки кишечника получали из предварительно смытого, как описано выше, фрагмента слизистой путем его растирания с девятикратным (масса/объем) количеством раствора Рингера в стерильной ступке.
Определяли активность гидролитических ферментов, выделяемых бактериями кишечника, без их получения в чистой культуре и выделяемых чистыми культурами бактерий, а также активность ферментов, содержащихся в смывах со слизистой оболочки и в гомогенате слизистой.
Активность гидролитических ферментов, продуцируемых совокупностью бактерий кишечника, без их получения в чистой культуре, оценивали следующим образом. В пробирки, содержащие 10 мл жидкой питательной среды, вносили 0.1 мл смыва с кишечника или гомогената. Для определения протео-литической активности использовали сухой рыбопептонный бульон (35 г (среда 1П) или 3.5 г (среда 2П)) на 1 л раствора Рингера, амилолитиче-ской активности — среду Имшенецкого (среда 1А) или 3.5 г рыбопептонного бульона и 10 г раствори-
мого крахмала на 1 л раствора Рингера (среда 2А). Посевы культивировали в течение 3 сут при температуре 25°С, после чего определяли активность ферментов бактерий.
Чистые культуры бактерий получали, высевая 0.1 мл неразведенных и разведенных в 10, 100 и 1000 раз смывов или гомогената на твердые питательные среды: "голодный" агар, кровяной агар, 1.5%-ный мясо-пептонный агар, висмут-сульфит агар, среды Эндо и Плоскирева. Через 48—72 ч культивирования при температуре 25°С выросшие колонии пересевали на скошенный питательный агар и идентифицировали. Выделенные штаммы идентифицировали на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических критериев с применением планшетных тест-систем "ЕОТЕЯ01е81" и "№РЕЯМ1е81" (ЬАСНЕМА, Чехия). Для оценки ферментативной активности выделенных бактериальных культур проводили посев в количестве, одинаковом для всех штаммов — одна стандартная бактериологическая петля диаметром 3 мм в пробирку с 10 мл жидкой питательной среды. Активность гидролитических ферментов, выделяемых чистыми культурами бактерий, определяли после 3 сут культивирования при температуре 25°С. Штаммы пронумерованы по мере выделения. Для каждого выделенного штамма определена способность продуцировать протеолитическую и амило-литическую активности.
Определена также активность собственно кишечных ферментов, десорбированных со слизистой кишечника. Смывы ферментов, адсорбированных на пищеварительно-транспортной поверхности слизистой кишечника, получены по той же схеме, как и при исследовании бактерий. Активность ферментов кишечника измерена непосредственно в смывах без посевов на среды и разведений.
Амилолитическую активность (АА) (суммарную активность а-амилазы, КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы, КФ 3.2.1.3 и ферментов группы мальтаз, КФ 3.2.1.20) определяли модифицированным методом Нельсона по приросту гексоз [8]; протеоли-тическую активность (ПА) (активность трипсина, КФ 3.4.21.4, химотрипсина, КФ 3.4.21.1 и дипепти-даз, КФ 3.4.13.1-3.4.13.11) - методом Ансона [11] по приросту тирозина. Интенсивность развивающегося окрашивания, пропорционального активности ферментов, измеряли на спектрофотометре СФ-46. При расчете активности ферментов для выделенных в чистой культуре штаммов скорость гидролиза субстратов выражали в микромолях редуцирующих сахаров (АА) или тирозина (ПА) за 1 ч инкубации; при расчете ферментативной активности совокупности бактерий без выделения в чистой культуре - в микромолях редуцирующих сахаров или тирозина за 1 ч инкубации в расчете на 1 г влажной навески отрезка кишечника, с которого получен смыв. Активность десорбированных с кишеч-
ника ферментов рассчитывали на 1 г навески отрезка кишечника за 1 мин инкубации.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В полученных со слизистой кишечника смывах после их посева на питательные среды определена способность бактерий, ассоциированных со слизистой кишечника, продуцировать гидролитические ферменты — протеазы и амилазы (рис. 1). Установлено, что бактерии, с различной степенью прочности ассоциированные со слизистой кишечника, продуцируют гидролитические ферменты. Активность как протеаз, так и амилаз бактерий отмечена во всех полученных фракциях, она зависит от состава среды культивирования и снижается от фракции Д1 к фракции Д5. С помощью этого подхода показано, что совокупность различных бактерий, обитающих в кишечнике щуки, способна выделять гидролитические ферменты.
Следующий шаг в исследовании трофической роли микроорганизмов в кишечнике щуки — определение способности отдельных штаммов выделять гидролитические ферменты. Для этого из полученных фракци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.