БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 3, с. 414 - 419
УДК 577.152.1
ГИПЕРАКТИВАЦИЯ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ КРЫСЯТ
© 2008 г. Н.В. Хундерякова, М.В. Захарченко, А.В. Захарченко, М.Н. Кондрашова*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
142290Пущино Московской обл., ул. Институтская, 3; факс: (496)733-0553, электронная почта: mkondrashova23@inbox.ru
Поступила в редакцию 21.06.07 После доработки 20.07.07
Определена активность сукцинатдегидрогеназы митохондрий, не выделенных из клетки в средах, приближенных к физиологическим, на лимфоцитах, иммобилизованных в мазке крови на стекле. Исследована активность сукцинатдегидрогеназы у новорожденных крысят, имеющих естественный гиперадренергический статус, а также у взрослых животных при введении адреналина. У большей части новорожденных отмечена очень высокая активность, превышающая активность взрослых в покое в 7—8 или в 3 раза согласно принятому расчету или в 30 и 6 раз согласно нашему, более точному расчету. Полученные данные поддерживают развиваемое в нашей группе представление об избирательном взаимодействии адренергической регуляции с окислением янтарной кислоты, согласно которому адреналин и норадреналин специфически активируют окисление янтарной кислоты, а янтарная кислота в микромолярных концентрациях, присутствующих в крови, стимулирует выделение катехоламинов (сигнальное действие, реализующееся через рецепторы). Это взаимодействие — половина субстратно-гормональной системы регуляции, обеспечивающей связь между вегетативной нервной системой и процессами окисления в митохондриях иннервируемых органов. Установлено, что усиление окисления янтарной кислоты катехоламинами включает активацию более быстрых путей образования сукцината, чем полный цикл Кребса.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: новорожденные, адреналин, сукцинатдегидрогеназа, сукцинат, глиоксилатный цикл.
Физиологическое состояние новорожденных по сравнению со взрослыми животными характеризуется сильным сдвигом в сторону преобладания симпатической (адренергической) регуляции [1]. Степень ее значительно больше, чем у взрослых в состоянии физиологического адреналинового возбуждения, и по отношению к таковому представляет собой гиперактивацию или острую фазу стресса. Стимуляция физиологических функций адреналином включает избирательную активацию сукцинатдегидрогеназы (СДГ) [2—5]. Показано, что янтарная кислота (ЯНТ), действующая как субстрат окисления, является сигнальной молекулой, стимулирующей выделение адреналина и норадреналина. Это связывает состояние митохондрий с деятельностью вегетативной нервной системы, а именно с ее симпатическим отделом [6—9]. Су-
Принятые сокращения: СДГ — сукцинатдегидрогеназа, ЯНТ — янтарная кислота, МАЛ — малоновая кислота, ЭС — эндогенные субстраты, НСТ — нитросиний тетра-золий.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
ществует сигнальная связь и между метаболизмом митохондрий и парасимпатическим отделом нервной системы через взаимодействие а-кетоглутарата и ацетилхолина [10, 11]. Такие взаимодействия рассматриваются как новая ре-гуляторная физиологическая система — субстратно-гормональная [12]. Предлагаемое представление поддерживается открытием рецепторов именно к ЯНТ и а-кетоглутаровой кислоте [13]. Обнаружение двусторонней метаболической связи окислительных процессов в митохондриях с нервной регуляцией вносит новый вклад в исследование физиологической проблемы: каким образом нервная система «узнает» о состоянии регулируемых органов?
Сигнальное действие ЯНТ проявляется при микромолярных концентрациях, которые соответствуют ее содержанию в крови. Некоторые данные свидетельствуют о большем вкладе ЯНТ в метаболизм у новорожденных животных и человека по сравнению со взрослыми. В организме детей от рождения до месяца производится значительно большее количество ЯНТ по сравнению с таковым у людей после 18 лет. Количе-
ство сукцината в моче у новорожденных и у взрослых — 197 и 7,7 мМ/М креатинина соответственно [14]. Содержание ЯНТ в плазме новорожденных крысят — 400, а у взрослых животных — 50 или даже только 5 мкМ [13, 15]. Дыхание митохондрий крысят первых трех дней жизни стимулируется обычной субстратной концентрацией ЯНТ 5 мМ в 15 раз, а всеми другими субстратами — в 1,5—2 раза [15]. При этом микромолярные концентрации других субстратов не активируют дыхание, в то время как стимулирующее действие ЯНТ сохраняется при наномо-лярных концентрациях, а 500 мкМ ЯНТ стимулируют дыхание в 7 раз. Эти данные, по-видимому, указывают на необычно высокую активность СДГ у новорожденных.
Задачей настоящей работы было сопоставление активности СДГ взрослых и новорожденных крыс в митохондриях, не выделенных из клетки, в средах, приближенных к физиологическим, на лимфоцитах, иммобилизованных в мазке крови на стекле. Благодаря сохранению структурной организации и подбору состава сред на таких препаратах значительно лучше выявляется стимуляция активности СДГ введенным или эндогенным адреналином в организме, чем на выделенных митохондриях: 200—500% вместо 20—40% соответственно [16, 17]. Выявление этим методом активации СДГ у новорожденных позволит расширить развиваемое в нашей группе представление об избирательном взаимодействии адренергической регуляции с окислением янтарной кислоты, включающим активацию более быстрых путей образования ЯНТ, чем полный цикл Кребса [2, 17].
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследовали показатели 2-3-дневных новорожденных крысят (п = 13) из двух пометов и взрослых самцов (п = 12) весом 180—200 г линии Вистар, разведения вивария ИТЭБ РАН. Эвтаназию проводили углекислым газом. Исследованы две группы взрослых животных: интакт-ные (п = 6) в состоянии покоя и после 30 мин воздействия адреналина (п = 6) в физиологической стимулирующей дозе (25 мкг/100), введенного внутрибрюшинно. Все новорожденные исследованы без дополнительных воздействий адреналина.
Использован распространенный цитохимический метод определения активности СДГ по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ) [18—20], однако состав сред инкубации сильно изменен, поскольку традиционные цитохимические прописи не соответствуют современным
условиям работы с митохондриями [16]. Из крови, взятой после декапитации, делали тонкие мазки на стекле, высушивали их на воздухе, фиксировали в течение 30 с в 60%-ном ацетоне, затем инкубировали 60 мин при 37° в основной среде, содержавшей 1 мг (НСТ) в 1 мл. Дополнительно исследовали пробы с добавлением 5 мМ малоната и 5 мМ сукцината. Были использованы KCl ос.ч. («Реахим», Донецк, Россия), Succinic acid («Sigma», США), Malonic acid («Sigma»), KOH («Reanal», Венгрия), Nitro-blue tetrazolium («Dudley», Германия). Активность СДГ измеряли по средней площади окраски формазана, определяемой методом компьютерной видеомикроскопии на изображениях 30 лимфоцитов. Расчет активности СДГ проводили как принятым способом по средней площади окраски формазана в присутствии ЯНТ («общая активность»), так и модифицированным нами способом с вычитанием окраски без добавления ЯНТ на эндогенных субстратах (ЭС) в присутствии малоната (МАЛ) — ингибитора СДГ. Такой расчет позволяет учесть вклад в окисление и эндогенной ЯНТ. Поэтому получаемый результат ближе к истинной активности СДГ в митохондриях. В случаях когда общая активность СДГ сильно уменьшается, МАЛ не снижает, а повышает окраску проб на ЭС. Мы предполагаем, что это обусловлено повышением образования супероксида при очень слабом притоке электронов от ЯНТ или NAD-зависимых субстратов [21—23]. Эта ситуация создается МАЛ и не реализуется без него. Поэтому в таких случаях при расчете истинной активности мы вычитаем из показателей, полученных в присутствии 5 мМ ЯНТ, показатели пробы на ЭС. Результаты обрабатывали с помощью параметрических критериев. Вычисляли средние, стандартные отклонения и ошибки средних по группам животных. Достоверность различий оценивали с помощью i-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проанализировано восстановление НСТ в лимфоцитах на мазках крови в группе взрослых интактных животных и группе крыс после воздействия адреналина (рис. 1). Видно, что значения показателей восстановления НСТ на эндогенных субстратах и в присутствии малоната находятся на низком уровне (в пределах 0,50 мкм2), что свидетельствует об отсутствии вклада в окисление ЯНТ. Группы отличаются по величине третьего показателя, активности СДГ в присутствии ЯНТ. У интактных крыс активность СДГ в присутствии ЯНТ превышает уровень
со
I
со со со 5 а о ■В-
V
о со а
V
о
-О
et
со
о ^
с
3 -
2 -
1 -
кд; wi ХЖ
al
Рис. 1. Восстановление НСТ в лимфоцитах взрослых ин-тактных крыс в покое (n = 6) (а) и после 30 мин введения адреналина (n = 6) (б). Здесь и на рис. 2 и 3 серые столбцы
— восстановление НСТ на эндогенных субстратах, черные
— при добавлении 5 мМ малоната, заштрихованные — при добавлении 5 мМ сукцината. Представлены средние значения и стандартные отклонения по группе. * — Различия достоверны при p < 0,001
восстановления на ЭС только на 20%, а после воздействия адреналина активность СДГ увеличивается в 2—3 раза, достигая 1,4 мкм2.
У большинства новорожденных крысят выявлено значительное повышение всех показателей восстановления НСТ по сравнению с таковыми у взрослых даже после введения адреналина. На рис. 2 представлены такие результаты для большего помета. Данные расположены в порядке от самой высокой активности СДГ к низкой. Видно, что у большинства новорожденных активность СДГ в присутствии ЯНТ сильно повышена по сравнению с таковой у взрослых даже после введения адреналина. У первых четырех особей активность СДГ выше таковой у взрослых в покое в 7—8 раз. Уровень восстановления НСТ на ЭС у этих особей в 3—4 раза выше, чем у взрослых после введения адреналина. Важно, что МАЛ снижает это восстановление на 30 и даже 90%. Это указывает на значительный вклад в окисление эндогенной ЯНТ, что является следствием выраженной адренергической активации в организме новорожденных даже без дополнительных раздражителей. Видно также, что наряду с группой с гиперактивной СДГ у некоторых особей она ниже, но у
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.