НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 1, с. 19-22
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.15
ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ В СТРУКТУРАХ БЕЛОГО И СЕРОГО ВЕЩЕСТВ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2012 г. А. В. Разыграев
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН
Активность глутатионпероксидазы была изучена в структурах белого и серого веществ головного мозга половозрелых самок крыс с использованием Н202 в качестве восстанавливаемого субстрата и реактива Эллмана для регистрации убыли 0$Н. Максимальные значения активности (мкмоль ОЗНДмин мг белка)) выявлены для пирамид продолговатого мозга (белое вещество), минимальные — для передней ги-поталамической перивентрикулярной области, включающей ретрохиазматическую зону, и медиальной области перегородки (преимущественно серое вещество) (р < 0.01 в каждом из сравнений, Q-кри-терий Данна). Медианы для каждой из выборок составили: пирамиды продолговатого мозга — 1.16, оптическая хиазма — 1.02, обонятельный бугорок — 0.83, мозолистое тело — 0.71, передняя комиссу-ра — 0.66, медиальная область перегородки — 0.42, передняя гипоталамическая перивентрикулярная область — 0.37. Таким образом, по крайней мере в некоторых структурах белого вещества глутатион-пероксидазная активность выше, чем в областях серого вещества, что опровергает предположение о преобладании активности данного фермента в сером веществе.
Ключевые слова: глутатионпероксидаза, активность, мозг, распределение, белое вещество, серое вещество, крысы.
Ферменты группы глутатионпероксидаз (ГПО) катализируют восстановление пероксидов (ЯООН) с участием восстановленной формы глу-татиона (С8Н) по схеме:
ROOH + 2GSH
ROH + GSSG + H2O.
Пероксиды, являющиеся субстратами для ГПО, могут быть как органической, так и неорганической (Н202) природы. В отношении восстановления пероксида водорода в ткани нервной системы считается, что именно ГПО вносят основной вклад в данный процесс, в связи с чем понятен повышенный интерес исследователей к ГПО при оценке состояния антиоксидантной системы нервной ткани [1—4].
Уровни глутатионпероксидазной активности головного мозга млекопитающих определены в таких макроструктурах как ствол мозга, мозжечок, гипоталамус и т.п. [2, 4—6], однако очень мало имеется сведений о том, как распределена данная активность между белым и серым веществами. Фактически существует всего лишь одна работа, опубликованная еще в 1980 г., описывающая распределение активности ГПО среди различных структур головного мозга крысы, среди которых только одна структура (мозолистое тело) представляет белое вещество [7]. Поскольку в мозолистом теле по сравнению с прочими структу-
*Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3; тел.: (812) 3289805; факс: (812) 3282361; e-mail: alexeyrh@mail.ru.
рами была найдена минимальная ферментативная активность, может возникнуть представление о том, что для белого вещества характерны низкие уровни активности ГПО.
Настоящая работа посвящена определению уровней глутатионпероксидазной активности в нескольких структурах белого и серого веществ головного мозга крысы и сравнению их между собой. В настоящем исследовании выполнялась проверка предположения о том, что активность ГПО (а именно, Н202 : С8Н-оксид оредуктазная активность) в структурах серого вещества выше, чем в структурах белого вещества. В связи с этим с использованием пероксида водорода в качестве восстанавливаемого субстрата были определены и сравнены попарно подходящим критерием уровни активности в четырех структурах белого вещества (передней комиссуре, пирамидах продолговатого мозга, мозолистом теле и оптической хиазме) и трех структурах, представляющих серое или преимущественно серое вещество (обонятельные бугорки, перивентрикулярная ретрохиазматическая область и срединная область перегородки).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для эксперимента было использовано 23 самки крыс линии "Вистар" (возраст — 2—4 мес), полученных из питомника "Рапполово" РАМН, Санкт-Петербург. Животные находились не менее 11 дней в виварии с режимом освещения 12 ч
19
2*
света и 12 ч темноты. Крыс декапитировали во второй половине дневной фазы суток.
Идентификация, выделение и предварительная обработка структур. Анатомические области были идентифицированы с использованием атласа головного мозга крыс [8]. Из поперечного разреза, проходящего через ростральную часть гипоталамуса и конечный мозг, извлекали переднюю ко-миссуру (ее центральную часть), мозолистое тело (стволовую часть, включая поясок) и переднюю гипоталамическую перивентрикулярную область (включая ретрохиазматическую зону) каудально от оптической хиазмы к уровню фронтального края срединного возвышения. Пирамиды продолговатого мозга выделяли в виде фрагмента пирамидного тракта каудально от уровня средней части трапециевидного тела и в непосредственной близости от вентральной (срединной) щели. Срединную область перегородки, содержащую вертикальную ветвь диагонального пучка Брока и медиально расположенные септальные ядра, извлекали в виде участка шириной 1 мм спереди от центральной части передней комиссуры до продольной щели, вдающейся в перегородку. Образцы обонятельных бугорков получали посредством снятия поверностного слоя коры в каудаль-ных участках соответствующей области мозга. В качестве образцов ткани оптической хиазмы использовали ее заднюю часть, включая область перехода в оптический тракт. Соответствующие участки извлекали при помощи лезвий из мозга, предварительно замороженного и хранящегося при —85°С. Все используемые анатомические структуры и области хорошо различимы в составе замороженной ткани, и для их правильного иссечения не требуется применение каких-либо дополнительных способов идентификации.
Гомогенаты ткани готовили с использованием стеклянного гомогенизатора на 0.05 М трис-НС1 буфере (рН 8.5), содержащем 0.34 мМ ЭДТА. Го-могенат центрифугировали 10 мин при 1000 g, су-пернатант использовали для определения активности ГПО [9].
Определение глутатионпероксидазной активности осуществляли с применением метода, описанного в работах [9, 10]. Раствор С8Н и NN в трис-НС1 буфере с ЭДТА (90 мкл, 1.16 мМ С8Н и 11.6 мМ NN3) преинкубировали в течение нескольких минут при 37°С, после чего вносили 10 мкл биологического материала (либо трис-НС1 буфера с ЭДТА с целью оценки неферментативного окисления С8Н). Далее через 60 с вносили 4 мкл 10 мМ Н2О2. Реакцию останавливали внесением 20 мкл 30% ТХУ через 60 с после добавления перекиси. Для выявления значений, соответствующих начальной концентрации С8Н, в идентичным образом приготовленные пробы, содержащие и не содержащие биологический материал,
раствор ТХУ добавляли сразу после внесения Н2О2 (0 с).
После добавления ТХУ денатурировавший белок осаждали центрифугированием (1000 ^ 10 мин), су-пернатант отбирали для взаимодействия С8Н с реактивом Эллмана. Белковый осадок растворяли в 1 М №ОН и использовали для определения содержания белка турбидиметрическим методом с применением ТХУ и регистрацией оптической плотности при 340 нм [9, 11].
При расчете ферментативной активности находили разность в оптической плотности между пробами, для которых время инкубации составляло 0 с и 60 с, как в случае присутствия фермента в реакционной среде (dE1), так и в случае неферментативной реакции (dE2). Далее расчеты производили по формуле: (dE1 — dE2)/Eo", где Eo" — оптическая плотность для пробы, не содержащей фермент, и временем инкубации, равным 0 с, и соответствующая концентрации С8Н, равной 1 мкмоль/мл реакционной смеси. Полученный результат делили на содержание белка в реакционной смеси (мг/мл) и получали значение удельной активности ГПО, выраженное в мкмолях С8Н/(мин мг белка).
Описание данных и их статистическая обработка. Ввиду малочисленности данных и, как следствие, невозможности оценки характера распределения изучаемого признака, результаты представлялись в виде первичных данных и медиан для каждой из семи групп, что позволило избежать искажения и потери информации о выборках. Статистические сравнения осуществлялись с использованием Р-критерия Данна, позволяющего корректно выполнить попарные сравнения с учетом того, что сравниваемых групп более двух [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты определений удельной активности ГПО, выполненных на образцах структур мозга, представлены в таблице. Наиболее высокие значения выявлены в пирамидах продолговатого мозга, т. е. в структуре, представляющей белое вещество. Для передней гипоталамической пери-вентрикулярной области, где в основном сосредоточены гипоталамические ядра, и для срединной области перегородки (также преимущественно серое вещество) найдены минимальные значения активности ГПО. Предположения о случайном характере различий между двумя упомянутыми структурами и пирамидами продолговатого мозга опровергаются на высоком уровне значимости (вероятность ошибки I рода <1%). При множественном сравнении не выявляются статистически значимые различия с участием остальных пяти исследованных структур. Вполне вероятно, что таковые могут быть выявлены при увеличении
ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ 21
Глутатионпероксидазная активность (мкмоль 08Н/(мин мг белка)) в структурах белого и серого веществ головного мозга крыс
Структура Р X т С А 8* Я*
Индивид. 1.48 $ 1.11 $ 0.96 " 0.81 л 0.85 $ 0.52 " 0.43 л
значения 1.42 " 1.02 $ 0.94 # 0.75 л 0.66 $ 0.50 " 0.38 л
1.35 $ 1.01 $ 0.90 " 0.67 л 0.61 $ 0.34 " 0.36 л
1.24 # 0.83 ' 0.44 л 0.31 " 0.32 л
1.16 " 0.72 #
1.13 # 0.71 #
1.10 ' 0.58 '
1.01 #
0.92 '
Медиана 1.16 1.02 0.83 0.71 0.66 0.42 0.37
Структуры белого вещества: А — передняя комиссура, С — мозолистое тело (ствол), Р — пирамида продолговатого мозга, Х — оптическая хиазма (каудальная часть, включая переход в зрительные пути); структуры серого и преимущественно серого веществ: Я — передняя гипоталамическая перивентрикулярная область (включая ретрохиазматическую зону), 8 — срединная область перегородки (включает в себя также волокна вертикальной ветви диагонального пучка Брока), Т — обонятельный бугорок. Индивидуальные значения, помеченные одинаковы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.