НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 3, с. 232-236
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.352
ГЛЮКОЗНАЯ ДЕПРИВАЦИЯ ПОТЕНЦИРУЕТ ТОКСИЧНОСТЬ УАБАИНА И ГЛУТАМАТА В КОРТИКАЛЬНЫХ НЕЙРОНАХ РАЗЛИЧНЫХ СРОКОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
© 2009 г. Е. Р. Лозиер1, А. И. Джанибекова1, Е. В. Стельмашук2, А. В. Граф3, Д. Б. Зоров1, Н. А. Соколова3, Н. К. Исаев1, 2*
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского МГУ, Москва 2Государственное учреждение научный центр неврологии РАМН, Отдел исследования мозга, Москва 3Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Добавление глутамата (Глу) на 24 ч в питательную среду вызывает дозозависимую гибель нейронов, полученных из коры головного мозга эмбрионов крыс и культивированных 9-10 дней, но не оказывает токсического влияния на нейроны, культивированные 4-5 дней, что говорит об их нейрохимической незрелости. При одновременном действии глюкозной депривации (ГД) и Глу, ГД усиливала на 15% токсическое действие низких концентраций Глу в зрелых культурах, но не оказывала влияния на токсичность высоких концентраций этого нейромедиатора. В незрелых культурах ГД потенцировала действие Глу независимо от концентрации этого нейромедиатора. Ингибирование Na+/K+-ATФазы уабаином вызывало гибель части нейронов. В условиях нормогликемии уабаин снижал выживаемость зрелых нейронов до 67 ± 4 и до 79 ± 5% незрелых, а в условиях ГД - до 28 ± 4 и до 56 ± 3% соответственно. Токсичность уабаина заметно уменьшалась при блокаде ионотропных глутаматаных рецепторов МК-801. Сама по себе 3-часовая ГД не вызывала достоверного увеличения гибели этих клеток. Таким образом, ГД резко увеличивает чувствительность нейронов к токсическим воздействиям опосредованных активацией NMDA-подтипа ионотропных Глу-рецепторов, даже в случае их нейрохимической незрелости.
Ключевые слова: глюкозная депривация, уабаин, культивированные нейроны, глутамат.
Гиперактивация глутаматных рецепторов вовлечена в процессы деградации нейронов при целом ряде патологических состояний мозга, таких как травма, ишемия и гипоксия, несмотря на различие их клинических симптомов [1-4]. В головном мозге при таких патологиях происходит накопление внеклеточного глутамата (Глу) и аспартата, которое, по мнению многих авторов, является результатом как усиленного выброса их из нервных окончаний, так и нарушения функционирования АТФ-зависи-мых систем обратного захвата этих медиаторов [5]. Этот процесс можно смоделировать в культурах нейронов, ингибируя Na+/K+-ATФазу [6]. Однако особый интерес представляет токсическое действие Глу на фоне различных патологических факторов, в том числе и при энергетическом голодании, что наблюдается при ишемии, гипоксии и гипогликемии. Этот вопрос мы исследовали в нашей работе, используя нейроны коры головного мозга крыс различных сроков культивирования, поскольку влияние повреждающих факторов на нейрохимически зрелые и незрелые нейроны может быть различным [7, 8].
* Адресат для корреспонденции: 1119991, Москва, Воробьевы горы, МГУ, НИИ ФХБ, Лабораторный корпус "А", e-mail: isaev@genebee.msu.ru
МЕТОДЫ
Для выделения коры головного мозга крыс использовали 17-18-дневные эмбрионы. Выделенные фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°С в смеси, приготовленной на фосфатном буфере и содержащей 0.05% трипсина, 0.02% ЭДТА, 0.8% глюкозы. После инкубации ткань промывали в трех сменах фосфатного буфера и подвергали механической диссоциации в питательной среде следующего состава: 90% минимальной среды Игла, 10% эмбриональной сыворотки, 2 мМ глу-тамина, 10 мМ HEPES pH, 7.2-7.4. Суспензию клеток центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин, су-пернатант сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде. После подсчета клеток в ге-моцитометре суспензию клеток разводили до концентрации 6 х 105 клеток в 1 мл среды, и по 100 мкл такой суспензии вносили в каждую ячейку 96-луночной камеры. Культивирование проводили в бессывороточной нейробазальной среде с добавкой В-27 (Life Technologies/BRL, Eggenstein, Germany) и 0.5 мМ L-глутамина [9]. Культуры развивались в С02-инкубаторе при температуре 36.5°С и относительной влажности 98%. В течение всего времени культивирования в этих культурах дважды в неделю производили смену поло-
100
75
л
Ö о
| 50
25
А
0 0.05 0.1 0.25 0.5 1.0 Концентрация глутамата в мМ
100
75
е 50
а
25
0 0.05 0.1 0.25 0.5 1.0 Концентрация глутамата в мМ
Рис. 1. Зависимость выживаемости нейронов в 9-10-дневных (А) и 4-5-дневных (Б) культурах коры головного мозга крыс от концентрации Глу в среде культивирования.
0
0
вины объема среды культивирования. Прижизненные наблюдения за развитием культур проводили в инвертированном микроскопе "IMT-2 Olympus".
В экспериментах по определению степени нейрохимической зрелости нейронов глутамат добавляли непосредственно в среду культивирования на 24 ч. При подготовке других экспериментов все культуры дважды промывали сбалансированным солевым раствором, содержащем (в мМ): NaCl 154, KCl 5, CaCl2 2.3, MgCl2 1, NaHCO3 3.6, Na2HPO4 0.35, HEPES 10, pH 7.3 и делили на две группы. Как первую, так и вторую группы культур инкубировали в этом же растворе в течение 3 ч с различными концентрациями глутамата или с 1 мМ уабаина, но сбалансированный солевой раствор второй группы содержал 1 г/л глюкозы. Блокатор NMDA-подтипа глутаматных рецепторов МК-801 (10 мкМ) добавляли в часть культур одновременно с уабаином. Культуры после действия Глу на фоне ГД переносили в среду культивирования на 24 ч.
Оценку жизнеспособности нейронов проводили с помощью МТТ теста, по метаболизму клетками тетразоливого красителя. Для этого культуры инкубировали 30 мин с 0.5 мг/мл MTT, лизировали ди-метилсульфоксидом и определяли оптическую плотность лизата. Оптическую плотность в контрольных культурах принимали за 100% выживаемости клеток, а в культурах, обработанных экспериментальными веществами, выживаемость вычисляли как процент от контроля. На каждую точку было использовано не менее 12 культур из трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде M ± S.E.M. Статистический анализ осуществляли с использованием критерия ANOVA с последующим сравнением при помощи теста Newman- Keuls при уровне значимости P < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Определение нейрохимической зрелости нейронов. Нейрохимическую зрелость нейронов коры головного мозга, культивированных 4-5 и 9-10 дней, определяли по чувствительности к различным концентрациям Глу. В культурах, которые развивались 9-10 дней, Глу через 24 ч вызывал интенсивную дозозависимую гибель нейронов, тогда как те же концентрации Глу в 45-дневных культурах практически не влияли на жизнеспособность нейронов (рис. 1). Таким образом, нейроны, которые культивировались 45 дней, значительно отличаются по нейрохимической зрелости от нейронов, развивавшихся в условиях культивирования 9-10 дней.
2. Влияние ингибирования Ыа+/К+-АТФазы на жизнеспособность нейронов при ГД и нормогли-кемии. 3-х часовая ГД не вызывала достоверного увеличения гибели нейронов (была лишь незначительная тенденция снижения выживаемости). Ингибирование Na+/K+-АТФазы уабаином (Уа) при нормальном содержании глюкозы в сбалансированном солевом растворе снижало выживаемость зрелых нейронов до 67 ± 4%, а незрелых только до 79 ± 5% (МТТ-тест). При действии Уа на фоне ГД выживаемость нейронов снижалась до 28 ± 4% в зрелых и до 56 ± 3% в незрелых культурах. Токсичность Уа полностью предотвращалась при добавлении в инкубационный раствор с нормальным содержанием глюкозы неконкурентного блокатора NMDA-рецепторов МК-801 и достоверно снижалась, если в инкубационном растворе глюкозы не было (рис. 2).
3. Влияние Глу на жизнеспособность нейронов при ГД и нормогликемии. В следующих экспериментах клетки подвергали комбинированному воздействию ГД и различных концентраций Глу в течение 3 ч. После такой обработки культу-
75 -
50-
СР
25 -
< .'Ь , ^ # #
Рис. 2. Влияние Уа на выживаемость нейронов в 9-10-дневных (А) и 4-5-дневных (Б) культурах коры головного мозга крыс при нормогликемии (черные столбики) и ГД (белые столбики). * Достоверное отличие от соответствующего контроля.
** Достоверное отличие токсического действия Уа при ГД от такового при нормогликемии.
*** Достоверное отличие значений выживаемости при нахождении в среде инкубации Уа + МК-801 и глюкозы от такого же воздействия на фоне ГД.
100
75
#
л н о о
В 50 л я к
л
га
25
0
25
50
100
Концентрация глутамата в мМ
га 25
0
25
50 100
Концентрация глутамата в мМ
Рис. 3. Влияние Глу на выживаемость нейронов в 9-10-дневных (А) и 4-5-дневных (Б) культурах коры головного мозга крыс при нормогликемии (черные столбики) и ГД (белые столбики). * Достоверное отличие действия Глу без глюкозы от действия в присутствии глюкозы.
ры переносили в нормальную среду культивирования без добавок на 24 ч. Результаты экспериментов показали, что добавление различных концентраций Глу в инкубационный раствор вызывало дозозависимую гибель зрелых нейронов при нормогликемии. Так, если при действии 25 |М Глу выживало 67 ± 2%, то при 100 |М - 50 ± ± 2.7%. ГД достоверно усиливала токсическое действие низких концентраций Глу в среднем на 15%, но не оказывала влияния на токсичность высоких концентраций Глу. В незрелых культурах добавление Глу в инкубационный раствор независимо от концентрации вызывало гибель лишь 18 ± ± 2% нейронов, что указывало на насыщение рецепторов уже при минимальной использованной концентрации Глу - 25 |М. ГД также независимо
от концентрации Глу потенцировала токсичность этого нейромедиатора и увеличивала гибель на 30% (рис. 3).
ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что нейрохимически незрелые и зрелые нейроны различаются по уровню экспрессии рецепторов к возбуждающим медиаторам, зрелости систем антиоксидантной защиты и систем поддержания ионного гомеостаза в нейронах. Механизмы развития повреждений у незрелых нейронов также могут существенно отличаться от таковых у зрелых клеток.
В настоящее время, по литературным данным, вопрос о чувствительности к возбуждающим ами-
0
нокислотам нейронов на разных стадиях их нейрохимической дифференцировки не вполн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.