ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 2, с. 205-210
УДК 581.19:577.152.24
ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ САХАРОЗОФОСФАТСИНТАЗЫ И САХАРОЗОСИНТАЗЫ
САХАРНОЙ СВЕКЛЫ
© 2004 г. В. Д. Сакало, В. М. Курчий
Институт физиологии растений и генетики Национальной академии наук Украины, Киев
Поступила в редакцию 08.04.2003 г.
Исследовали влияние синтетических гормональных препаратов (БАП, ИУК, ГК) на активность ферментов синтеза и метаболизма сахарозы - сахарозофосфатсинтазы (СФС, К.Ф. 2.4.1.14) и саха-розосинтазы (СС, К.Ф. 2.4.1.13), содержание хлорофилла и белков в онтогенезе сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Уладовская односемянная 35 (УО-35). При обработке растений, а также непосредственном взаимодействии с ферментом, гормональные препараты активировали СФС листьев. Интенсивность активации СФС разными соединениями различалась и менялась в онтогенезе листа. Под влиянием гормональных препаратов сохранялся высокий уровень белков, задерживалось разрушение хлорофилла, а значит, продлевалась функциональная активность листьев в онтогенезе. Активность СС корнеплодов сахарной свеклы, как при обработке растений гормональными препаратами, так и при непосредственном взаимодействии их с ферментным препаратом, практически не изменялась. Высказывается предположение, что в корнеплодах сахарной свеклы активность СС, скорее всего, контролируется сахарозой, синтезированной в листьях, а не экзогенными гормональными препаратами. Влияние последних на метаболизм листьев в основном проявлялось в усилении ростовых процессов.
Beta vulgaris - сахарозофосфатсинтаза - сахарозосинтаза - хлорофилл - гормональные препараты
Сахарозофосфатсинтаза (СФС) - ключевой фермент биосинтеза сахарозы, играет важную роль в распределении фотоассимилятов между сахарозой и крахмалом в листьях [1]. Синтез сахарозы фактически состоит из двух реакций: СФС из уридиндифосфатглюкозы (УДФГ) и фруктозо-6-фосфата образует сахарозофосфат, который при участии сахарозофосфатфосфатазы превращается в сахарозу с освобождением Р;. Реакция синтеза сахарозы является необратимой, в результате происходит накопление дисахарида, включение его в русло транспорта и использование для вторичных синтезов в запасающих органах. До включения сахарозы в метаболизм происходит ее расщепление сахарозосинтазой (СС) или гидролиз инвертазой. Эти ферменты могут контролировать интенсивность поступления сахарозы в клетки запасающих органов и предопределять в них ее уровень.
Сокращения: ДТТ - дитиотрейтол, Мопс - морфолинопро-пансульфоновая кислота, СФС - сахарозофосфатсинтаза, СС - сахарозосинтаза, УДФГ - уридиндифосфатглюкоза. Адрес для корреспонденции: Сакало Валентина Дмитриевна. 03022 Киев, ул.Васильковская, 31/17. Институт физиологии растений и генетики. Факс: 38044-2575150; электронная почта: kurchii@ifrg.freenet.kiev.ua
СФС осуществляет контроль за поступлением фотосинтетически ассимилированного углерода в сахарозу и, таким образом, может служить индикатором ее синтеза. СС катализирует метаболизм, связанный с такими процессами, как синтез крахмала в листьях, используя для этого часть сахарозы, а в корнеплодах сахарной свеклы ответственна за сахаронакопление и рост [2, 3]. В отношении инвертазы показано, что у сахарной свеклы в процессе сахаронакопления происходит ее ингибирование [4].
СФС локализована в цитоплазме фотосинте-зирующих клеток, ее активность подвержена нескольким уровням эндогенной регуляции и тесно связана с фотосинтезом. Прямая корреляция между интенсивностью фотосинтеза и активностью СФС обнаружена в листьях ячменя, что связано с поступлением в цитоплазму первичных продуктов фотосинтеза - триозофосфатов, являющихся предшественниками сахарозы [5]. Показано, что при лимитировании света и С02 снижение синтеза сахарозы происходит в результате изменения уровня метаболитов, непосредственно регулирующих СФС, - глюкозо-6-фосфата, активирующего фермент, и Рi - ингибитора [6]. В сложной системе эндогенной регуляции СФС есть механизмы, которые координируют связь между
интенсивностью фотосинтеза и образованием сахарозы [7, с. 64].
Представляют интерес механизмы регуляции активности ферментов, которые катализируют биосинтез сахарозы и ее использование в метаболизме. Показано влияние ионов Mg2+ и Mn2+, анионов - цитрата и фосфата, метаболитов - ди- и трифосфатов на активность СФС [8]. Но несмотря на то, что СФС является основным ферментом синтеза сахарозы в листьях, изучена она недостаточно, особенно у сахарной свеклы. Так, практически не изучен вопрос гормональной регуляции СФС. В отношении гормональной регуляции СС нет единой точки зрения. Claussen с соавт. [9] установили, что ГК, ИУК и кинетин не активируют СС у баклажана. Вместе с тем показано, что АБК в проростках пеннисетума [10] и ИУК в корнеплодах сахарной свеклы [11] стимулируют фермент.
Цель настоящего исследования состояла в выяснении возможности регуляции фитогормонами (ИУК, ГК) и БАП - синтетическим аналогом ци-токинина, активности СФС, их влияния на состояние ассимиляционного аппарата в листьях разного возраста, на СС корнеплодов сахарной свеклы и ростовые процессы.
МЕТОДИКА
Растения сахарной свеклы Beta vulgaris L. сорта Уладовская односемянная 35 (УО-35) выращивали в 15-килограммовых вегетационных сосудах с темно-серой оподзоленной почвой, с внесением питательной смеси ВНИС, разработанной в Институте сахарной свеклы (ранее ВНИС), и одноразовой подкормкой в середине вегетации нитроаммофоской (5 г на сосуд). Повторность опытов -15-кратная. Надземную часть растений сахарной свеклы опрыскивали испытуемыми растворами дважды на протяжении вегетации в период образования 6-8-го листа (26 июня) и в начале интенсивного сахаронакопления (19 июля), когда уже был сформирован второй десяток листьев. Гормональные препараты применяли в следующих концентрациях: БАП - 4 х 10-5 М, ИУК - 1 х 10-6 М, их смесь 1 : 1, ГК3 - 100 мг/л, контролем служила вода. Все препараты фирмы "Serva" (Германия).
Отбор образцов каждый раз проводили в одно и то же время в солнечный день. Навеска растительного материала состояла из дисков определенного диаметра, высеченных пробочным сверлом ближе к основанию листовой пластинки без центральной жилки. Высечки брали из 12-14-го листа каждого из 10 растений в течение онтогенеза. Для определения активности СС навеску брали из 5-10 корнеплодов.
Выделение СФС и определение ее активности проводили по модифицированному нами методу
Huber с соавт. [12]. Навеску листьев - 500 мг растирали с 8 мл 50 мМ Мопс (морфолинопропансуль-фоновая кислота)-КаОН-буфера, рН 7.5, с добавлением 15 мМ MgC12, 6 мМ дитиотрейтола (ДТТ), 1 мМ ЭДТА и 0.1% (вес/объем) Тритона Х-100. Отжатый через капроновую ткань гомогенат центрифугировали при 20000 g в течение 15 мин. Су-пернатант пропускали через Sephadex G-25 ("Pharmacia", Швеция), помещенный в тефлоно-вые трубки для гель-фильтрации и уравновешенный тем же буфером, но без Тритона Х-100. Эти трубки помещали в центрифужные пробирки и после нанесения белкового экстракта центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин. Полученный ферментный препарат (4-5 мл) сразу же использовали для определения содержания белка и активности фермента.
Инкубационная смесь при насыщающем уровне субстратов содержала (в мкмолях): УДФГ -0.75; глюкозо-6-фосфат - 3; фруктозо-6-фосфат -0.75; MgC12 - 1.1; ДТТ - 0.2, а также 5 мкл 50 мМ Мопс-КаОН-буфера, рН 7.5, и 45 мкл ферментного препарата. Общий объем смеси - 75 мкл, время инкубации - 30 мин при 35°С. Реакцию останавливали добавлением 75 мкл 30%-ной КОН. Не-прореагировавшую фруктозу разрушали кипячением в течение 10 мин со щелочью. Активность СФС определяли по количеству образовавшейся сахарозы резорциновым методом [13].
Содержание хлорофиллов a и b в листьях определяли безмацирационным методом после экстракции высечек определенной массы и площади диметилсульфоксидом при 65°С в течение 4 ч [14]. Оптическую плотность измеряли при 645 , 652 и 663 нм на Specord М-40 ("Carl Zeiss", Германия).
Для выделения СС и определения ее активности навеску (5 г) растирали с 30 мл буфера, состоящего из 0.05 М Трис-НС1, рН 7.5, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, 10 мМ MgC12. Гомогенат отжимали через капроновую ткань, центрифугировали 15 мин при 20000 g, супернатант высаливали сульфатом аммония до 30%-ного насыщения. Через 40 мин этот раствор центрифугировали, и супернатант снова высаливали до 70%-ного насыщения. После следующего центрифугирования осадок растворяли в 3-4 мл буфера и диализиро-вали на протяжении ночи. Диализированный раствор использовали как источник фермента.
Инкубационная смесь для определения СС в реакции расщепления сахарозы содержала: УДФ -2.5 мкмоль, сахарозу - 20 мкмоль, 0.1 М цитрат-ный буфер, рН 6.4 - 50 мкл, ферментный препарат - 50 мкл. Общий объем смеси - 0.2 мл. Активность определяли по количеству образовавшейся фруктозы арсеномолибдатным методом [15]. Белок определяли по Lowry с соавт. [16].
Все операции с ферментами проводили на холоде.
ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ САХАРОЗОФОСФАТСИНТАЗЫ Таблица 1. Содержание белков в онтогенезе листьев сахарной свеклы (мг/г свежей ткани)
Вариант
Дата отбора проб
9 июля 24 июля 6 августа 20 августа 3 сентября 18 сентября
Контроль 49.2 ± 1.2 46.5 ± 2.5 47.6 ± 1.6 46.8 ± 0.2 28.6 ± 1.3 25.4 ± 0.2
БАП 43.7 ± 0.1 51.1 ± 1.4 40.9 ± 1.9 50.6 ± 1.1 42.5 ± 1.1 37.9 ± 1.6
ИУК 46.7 ± 0.8 45.8 ± 0.1 63.2 ± 0.1 52.4 ± 0.7 46.2 ± 1.2 50.4 ± 1.2
БАП + ИУК 42.0 ± 3.0 55.9 ± 0.7 43.8 ± 2.1 44.9 ± 0.7 42.5 ± 1.5 38.2 ± 0.4
ГК 54.2 ± 1.1 43.8 ± 2.0 48.0 ± 0.1 60.6 ± 1.4 49.2 ± 2.6 52.8 ± 1.1
Таблица 2. Влияние гормональных препаратов на рост сахарной свеклы
Вариант Масса листьев, г Масса корнеплодов, г Сахаристость, %
дата отбора проб
9 июля 6 августа 17 сентября 9 июля 6 августа 17 сентября 17 сентября
Контроль 145.5 330 260 39.5 220 550 18.6
БАП 166.5 360 320 42.0 270 540 18.7
ИУК 154.0 345 330 43.0 230 580 18.5
БАП + ИУК 169.0 330 330 43.5 230 570 18.2
ГК 173.0 400 320 40.0 270 780 16.0
НСРБ 0.05 24.9 30.5 50.5 5.09 77.5 126.4 0.2
На рисунках и в табл. 1 представлены средние арифметические результ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.