ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 416, № 2, с. 274-277
= ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 599.742.7
ГОРМОНАЛЬНЫЙ ОТВЕТ НА ВВЕДЕНИЕ
СИНТЕТИЧЕСКОГО АНАЛОГА АДРЕНОКОРТИКОТРОПНОГО ГОРМОНА У РЫСЯТ (LYNX LYNX L.) © 2007 г. С. В. Найденко, А. Л. Антоневич, М. Н. Ерофеева
Представлено академиком Д.С. Павловым 20.03.2007 г. Поступило 22.03.2007 г.
В последние годы все большее распространение получает применение АКТГ-теста на различных видах животных (ACTH-challenge test). Его используют в основном для оценки состояния животного (степени стрессированности) перед инъекцией [1] или для выявления метаболитов глюко-кортикоидов в экскретах при разработке неинва-зивных методов гормонального мониторинга [2]. Введение АКТГ (адренокортикотропного гормона) ведет к резкому повышению концентрации глюкокортикоидов в плазме крови изученных млекопитающих. Метаболиты экскретированных в кровь гормонов через определенный период времени выделяются из организма с мочой и экскрементами. Их определение в экскретах и выявление пика, соответствующего выбросу гормона в кровь, составляют основу для валидирования разрабатываемых неинвазивных методов гормонального мониторинга.
Вместе с тем гормональный ответ на введение АКТГ у диких кошачьих изучен явно недостаточно. Лишь в отдельных случаях наряду с концентрацией глюкокортикоидов в плазме крови оценивали уровень тестостерона и лютеотропного гормона [3]. Изменения в экскреции других гормонов надпочечников никогда не были прослежены. Однако если инъекция АКТГ может вести к увеличению экскреции и других гормонов надпочечников, то это в значительной степени может затруднять разработку неинвазивных методов из-за увеличения в экскретах концентраций метаболитов других гормонов, зачастую сходных по структуре. Возрастные изменения реакции на инъекцию АКТГ, а также особенности подобной реакции в раннем постнатальном онтогенезе вообще не исследованы.
Рысь (Lynx lynx) - один из наиболее широко распространенных диких представителей семейства кошачьих, ставший в последнее время модельным при проведении гормональных исследований. На нем изучается сезонная динамика экскреции половых гормонов и особенности их метаболизма [4, 5]. Однако предварительные исследования, в том числе и с использованием АКТГ-теста, не позволили пока разработать метод неинвазивного мониторинга уровня глюкокортикоидов у рыси (наши данные). Оценка влияния инъекции АКТГ на экскрецию различных гормонов в кровь даст возможность наметить пути решения этой проблемы. Кроме того, предварительные исследования поведения детенышей рыси в онтогенезе позволили предположить, что феномен внутривыводковой агрессии у рысят [6] может быть связан с функционированием надпочечников [4, 7]. Внутривыводковая агрессия у рысят отмечается в возрасте 36-64 сут, пик драк приходится на седьмую неделю развития детенышей. Введение в этом возрасте рысятам синтетического аналога АКТГ вело к атакам некоторыми из них однопометников в течение часа (наши данные). Целью настоящего исследования было оценить изменения в уровне гормонов у рысят после введения синтетического аналога АКТГ. Полученные данные необходимы для дальнейшей разработки неинвазивных методов исследований. Кроме того, мы попытались оценить различия в реакции на инъекцию у рысят разного возраста: в начале и конце периода внутривыводковой агрессии.
Работу проводили на научно-экспериментальной базе "Черноголовка" Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН в июне-июле 2006 г. Котят европейского подвида рыси (L. l. lynx), родившихся в мае 2006 г., содержали в вольерах площадью 74 м2 вместе с матерями [6, 7].
Инъекции синтетического аналога АКТГ (в дальнейшем - АКТГ) были проведены одиннадцати детенышам из четырех различных выводков
Институт проблем экологии и эволюции
им. А.Н. Северцова
Российской Академии наук, Москва
Кортизол, нг/мл
600 г
500 -
400 -
300 -
200 - ^^
100 - чг
0 |
0 30 60 90 120 Время после инъекции, мин
Рис. 1. Средний уровень кортизола в плазме крови рысят после инъекции АКТГ. Здесь и на рис. 2 и 3: ** - р < 0.01 при сравнении с контрольной пробой (точка 0).
в возрасте 37 (3 котенка), 43 (2), 58 (3) и 65 (3) сут. В утренние часы (8.00-10.30) детенышам внутримышечно вводили препарат Synacten (1 мг/мл, "No-vartis Pharma GmbH", Nürnberg), предварительно взвешивая каждого зверя и рассчитывая количество гормона для каждой особи относительно ее массы (0.25 мл/10 кг, т.е. 25 ИЕ/10 кг). Непосредственно перед инъекцией у рысенка брали контрольную пробу крови для последующего анализа уровня гормонов. Продолжительность временного интервала с момента отлова котенка до первого забора крови составляла до 10 мин, что позволяло рассматривать уровень кортизола в плазме крови как базальный [8]. Кровь собирали в количестве 0.5-1.5 мл из поверхностной вены плеча или бедренной вены через 30, 60, 90 и 120 минут после инъекции. Кровь центрифугировали (6000 об/мин, 20 мин), отбирали плазму, замораживали ее при -18°С и хранили при этой температуре до проведения измерений. Измерения уровня гормонов проводили методом иммуно-ферментного анализа с использованием коммерческих наборов компаний "Иммунотех" (Москва) для тестостерона, прогестрона, кортизола и де-гидроэпиандростерон-сульфата (ДГЭА), а также DRG (Германия) для андростендиона. Каждое измерение проводили дважды для определения коэффициента вариации, а для дальнейшей обработки принимали среднее значение. Статистическая обработка велась при помощи критерия Вилкоксона для сопряженных пар (для оценки изменения уровня гормонов после инъекции) и критерия Стьюдента (для сравнения изменений в уровне гормонов у детенышей двух групп разного возраста - до 45 сут и старше).
Базальный уровень кортизола у рысят составлял в среднем 98 ± SE14 нг/мл (lim 50-182 нг/мл) (рис. 1). Через полчаса после инъекции АКТГ он возрастал более чем в 3 раза, а максимального уровня (441 ± 46 нг/мл; lim 257-801 нг/мл) достигал через 120 мин после инъекции АКТГ. Уро-
Андростендион, нг/мл
0.14 г
0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 0
0 30 60 90 120 Время после инъекции, мин
Рис. 2. Средний уровень андростендиона в плазме крови рысят после инъекции АКТГ.
вень кортизола в плазме крови рысят был достоверно выше через 30, 60, 90 и 120 мин после инъекции по сравнению с контролем (везде T = 0, Z = 2.93; p < 0.01). Отмечена значительная индивидуальная вариабельность в реакции котят на инъекцию: глюкокортикоидный индекс варьировал от 1.9 до 12.6 (5.6 ± 1.1). При этом у всех пяти котят младшей группы пик кортизола достигался через 90 мин после инъекции, тогда как у более старших детенышей - лишь у одного из шести (тест сравнения долей p < 0.05), у остальных пяти - через 120 мин. В целом уровень кортизола увеличивался практически одинаково: в 5.4 раза у младших котят и в 5.7 раза у старших.
Базальный уровень тестостерона у рысят составлял в среднем 0.31 ± 0.05 нг/мл (lim 0.16-0.74). Уровень этого гормона не изменялся достоверно во время эксперимента (T = 21-32; Z = 0.18-1.07; ns), через 30-120 мин он был в среднем в 1.26-1.47 раза выше, чем перед инъекцией. У старших котят этот показатель возрастал вдвое, однако различия в реакции котят разного возраста были недостоверны (t = 1.22; df = 9; ns). Не отмечено достоверных изменений и в концентрации другого ан-дрогена - ДГЭА. Базальный уровень ДГЭА составлял 0.017 ± 0.004 нг/мл и через 1 ч после инъекции незначительно снизился.
Базальный уровень андростендиона в плазме крови рысят составлял 0.049 ± 0.01 нг/мл (рис. 2). Уровень андростендиона у рысят после инъекции АКТГ был достоверно выше базального в течение всего периода двухчасового исследования (T= = 0-2, Z = 2.60-2.85; n = 10-11; p < 0.01). Он возрастал более чем вдвое (2.3 ± 0.22), достигая максимального значения через 90 мин после начала теста у пяти рысят из девяти или через 120 мин (у четырех). У одного котенка не отмечено увеличения уровня андростендиона после инъекции, у
276
НАЙДЕНКО и др.
Прогестерон, нг/мл 9 8 7 6 5 4 3 2 1
0 —
0 30 60 90 120 Время после инъекции, мин
Рис. 3. Средний уровень прогестерона в плазме крови рысят после инъекции АКТГ.
остальных он возрастал в 1.4-3.5 раза. Различий у рысят разного возраста в увеличении уровня анд-ростендиона не регистрировали: он возрастал в 2.2 и 2.3 раза.
Во время теста базальные концентрации прогестерона у рысят были чрезвычайно низкими и составляли 0.42 ± 0.06 нг/мл. После введения АКТГ наблюдался резкий рост уровня прогестерона в плазме крови рысят, который превышал базальный уровень в течение всего двухчасового исследования (везде T = 0, Z = 2.80-2.93; n = 10-11; p < 0.01) (рис. 3). В среднем уровень прогестерона возрастал в 26.5 ± 7.5 раз (lim 5.8-74.1) и у восьми из десяти рысят был наибольшим через 2 ч после инъекции АКТГ (у еще двух детенышей - через 90 мин). Уровень прогестерона у рысят разного возраста также увеличивался примерно в одинаковой степени: в 24.7 и 28.2 раза.
Использование введения АКТГ для стимуляции деятельности надпочечников было ранее проведено у целого ряда кошачьих. Модельным видом наиболее часто служит домашняя кошка (Felis catus) [8], однако подобные эксперименты были проведены также на пуме (Puma concolor), гепарде (Acinonyx jubatus), тигре (Panthera tigris) и леопарде (Panthera pardus) [3]. После введения АКТГ уровень кортизола достоверно возрастал у всех видов [3]. При этом он достигал максимума у леопарда уже через 45 мин после инъекции, через 60 мин - у тигра, 75 мин - у гепарда, а у пумы продолжал увеличиваться и через 120 мин после инъекции. У домашней кошки в разных экспериментах пик кортизола имел подобие плато через 60 [10], 60-120 [9] и 180 [11] минут после инъекции АКТГ. В среднем пиковый уровень кортизола в плазме крови был максимальным у пумы (715.8 нг/мл) и леопарда (535.6 нг/мл), у тигра и гепарда он был значительно ниже (238.6 и 252.0 нг/мл) [3]. Следует отметить, что доза, вводимая всем животным в данном эксперименте, была одинаковой независимо от массы тела [12].
Инъекция АКТГ в таком случае вела к повышению уровня кортизола в плазме крови в 1.7 раза у тигра и 1.4 раз
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.