Биологические науки
Физико-химическая биология
Биотехнология
Балакина А.А., младший научный сотрудник Института проблем химической физики Российской академии наук Калашникова Е.А., доктор биологических наук, профессор Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А. Тимирязева
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА МОРФОГЕНЕЗ ЛЮПИНА УЗКОЛИСТНОГО (LUPINUS ANGUSTIFOLIUSL.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
В статье обсуждается вопрос о влиянии веществ цитокининового и ауксинового типа действия на морфогенетическую активность первичных эксплантов люпина узколистного. Показано, что присутствие 2,25 мкМ 6-БАП и 4,5 мкМ ИМК обеспечивает наивысший коэффициент размножения с одновременным сохранением способности микропобегов кризогенезу на протяжении 6 пассажей.
Ключевые слова: регуляторы роста, морфогенетика, регенерация, микропобеги, гормональный состав.
GROWTH REGULATORS EFFECT ON THE MORPHOGENESIS OF NARROW-LEAVED LUPIN (LUPINUSANGUSTIFOLIUSL.) IN VITRO
Effect of growth regulators on the morphogenetic activity of narrow-leaved lupin primary explants is discussed. The presence of 6-BAP (2,25 uM) and IBA (4,5 ¡uM) was shown to provide the highest multiplication ratio and to maintain microshoots ability to rooting for six regeneration rounds.
Keywords: growth regulators, morphological genetics, regeneration, micro sprouts, hormonal composition.
Некоторые виды рода Lupinus широко используются в мировом сельском хозяйстве в качестве источника белка для пищи человека и животных. Получение новых сортов люпина узколистного с использованием методов современной биотехнологии невозможно без подбора оптимальных условий клонального микроразмножения с целью достижения максимального коэффициента размножения. Применение высоких концентраций регуляторов роста, главным образом 6-бензиламинопурина (6-БАП), как правило, приводит к появлению ряда нежелательных эффектов, таких как снижение регенерационной способности, витрифика-ция, карликовость и потеря способности к корневому органогенезу (Nadolska-Orczyk 1992). Таким образом, является актуальным поиск альтернативных регуляторов роста, повышающих клональное микроразмножение люпина узколистного.
Целью нашей работы являлось изучение влияния различных регуляторов роста на мор-фогенетические процессы в культуре люпина узколистного.
Материалы и методы
В работе использовали следующие сорта и образцы люпина узколистного: Ладный, Деко, Куршавель, Миртан.
Все питательные среды были приготовлены на основе сред Мурасиге-Скуга (Murashige and Skoog 1962) и Гамборга (Gamborg et al. 1968) с добавлением 0,8 % агара (Bacto-Agar). Культуральные среды для индукции морфогенеза и микроразмножения содержали 87,64 мМ
сахарозы, а для укоренения - 58,43 мМ. Первичные экспланты и микропобеги культивировали при интенсивности света 3000 люкс, 16-часовом фотопериоде и температуре 24±10С. Продолжительность пассажа составляла 14 суток.
Опыты проводили в четырехкратной повторности. Данные экспериментов представлены в виде х ± ^05 • , где х - среднее значение, - ошибка средней, ¿05 - значение критерия Стьюдента.
Результаты и обсуждение
В настоящее время наиболее эффективным как для клонального микроразмножения, так и для трансформации является индукция развития верхушечных и пазушных почек люпина (Pniewski et al. 2002). На этапе введения в культуру in vitro нами были протестированы различные регуляторы роста (цитодеф, дропп, 6-БАП или кинетин в концентрации 2,25 мкМ) и проведена количественная оценка сформировавшихся регенерантов. В качестве первичного экспланта были использованы пазушные почки с семядолей и сегментом зародышевой оси, которые изолировали с 3, 7, 10-ти суточных проростков люпина узколистного (Рис. 1).
Рис. 1. Среднее количество побегов с одного экспланта, шт. А - 3-х дневные проростки, В - 10-ти дневные проростки
Полученные данные показали, что первичные экспланты, изолированные с 3 и 7-ми суточных проростков, существенно не отличались по регенерационной способности. Для сорта Миртан существенных различий между вариантами питательных сред не наблюдали, в то время как для сортов Куршавель, Деко и Ладный, наибольшее количество микропобегов было получено на среде в присутствии 6-БАП. Первичные экспланты, изолированные с 10-ти суточных проростков, обладали более низкой регенерационной способностью и существенные различия между вариантами питательных сред не были отмечены. Исключение составил сорт Деко, для которого наименьшую регенерационную способность наблюдали в присутствии кинетина. Таким образом, было показано, что для клонального микроразмножения исследуемых генотипов люпина узколистного целесообразно использовать экспланты, изолированные с 3-7-ми суточных проростков, что существенно упрощает этап введения их в стерильную культуру.
Для люпина узколистного получение высоких коэффициентов размножения напрямую связано с проблемой потери растениями способности к ризогенезу, а также развитием вит-рифицированных побегов. В наших исследованиях была предпринята попытка избежать не-
гативного действия 6-БАП на микрорастения люпина путем замены его на другие регуляторы роста такие, как цитодеф и дропп. Ранее нами были отмечены изменения в морфологии образовавшихся мериклонов люпина и снижение их способности к органогензу при культивировании исследуемых генотипов в течение нескольких пассажей в присутствии 6-БАП и кинетина в концентрации 2,25 мкМ и более, что согласуется с результатами других авторов (Pniewski 2002).
Экспериментальные данные показали, что замена 6-БАП на препараты дропп и цитодеф не оказывает существенного влияния на количество развивающихся микропобегов. Также было выявлено, что после двух циклов микроразмножения в присутствии данных регуляторов роста наблюдали те же изменения в морфологии микропобегов (карликовость и витри-фикация), что и на средах в присутствии 6-БАП и кинетина. Кроме того, растения-регенеранты индуцированные на средах с дропп и цитодеф не были способны формировать корневую систему в условиях in vitro. Таким образом, культивирование микропобегов исследуемых сортов люпина узколистного в присутствии 6-БАП является наиболее оптимальным и обеспечивает получение наибольшего количества мериклонов.
Ранее нами были выделены два наилучших варианта питательной среды содержащих ки-нетин и 6-БАП в концентрации 1,13 мкМ 2,25 мкМ, соответственно. В состав последней была также введена ИМК (4,5 мкМ), что позволило избежать негативных морфологических изменений при сохранении максимально возможного коэффициента размножения. Для сортов Миртан и Ладный были проведены исследования по изучению регенерационной способности в динамике в течение 6 пассажей (Рис. 2).
Рис. 2. Среднее количество микропобегов за один пассаж, шт
Из полученных результатов следует, что при длительном культивировании не наблюдается снижения способности к регенерации, и этот показатель не зависит от исследуемого варианта питательной среды. Показано, что культивирование микрорастений люпина на этих вариантах питательных сред позволяло получить мериклоны с нормальной морфологией и сохранением их способности к корневому органогенезу. Таким образом, показано, что для исследуемых генотипов люпина узколистного на этапе микроразмножения наиболее оптимальным является культивирование микропобегов в присутствии 2,25 мкМ 6-БАП и 4,5 мкМ ИМК.
Индукция ризогенеза у микропобегов люпина узколистного является одной из наиболее важных проблем при проведении трансформации. Наши исследования были направлены на определение влияния гормонального состава питательной среды на способность микрорасте-
ний люпина к укоренению. Количество укорененных регенерантов оценивали после различных этапов микроразмножения на среде в присутствии 4,5 мкМ ИМК (Рис. 3).
Рис. 3. Доля укоренившихся микропобегов, %
Анализ полученных данных показал, что гормональный состав питательных сред на этапе микроразмножения существенно не влияет на способность микрорастений исследуемых генотипов люпина узколистного к ризогенезу. После двух пассажей способность микропобегов к корнеобразованию существенно снижается, что подтверждено данными и других авторов (Pniewski 2002). Разработанный нами протокол клонального микроразмножения люпина узколистного позволяет индуцировать ризогенез даже после 6 пассажей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Gamborg O, Miller R Ojima K 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res 50:151-158
2. Murashige T, Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15:473-497
3. Nadolska-Orczyk A 1992 Somatic embriogenesis of agriculturally important lupin species (Lu-pinus angustifolius, L. albus, L. mutabilis) Plant Cell, Tissue and Organ Culture 28:19-25
4. Pniewski T, Kapusta J, Legocki AB 2002 In vitro micropropagation of four lupin species Acta Phisiol Plant 24:417-424
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.