ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 2, с. 186-194
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 581.1
ХАРАКТЕР УЧАСТИЯ ОЛИГОСАХАРИНА OS-RG В ИУК-ИНДУЦИРУЕМОМ ФОРМИРОВАНИИ АДВЕНТИВНЫХ КОРНЕЙ
© 2015 г. И. А. Ларская, Т. С. Барышева, А. И. Заботин, Т. А. Горшкова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань
Поступила в редакцию 02.07.2014 г.
Изучено взаимодействие ауксина и олигосахарина OS-RG естественного происхождения (СП~10) в процессе формирования адвентивных корней. Олигосахарин, выделенный из проростков гороха, повышал на 20-25% количество корней, индуцируемых ИУК как на сегментах гипокотилей гречихи (Fagopyrum esculentum Moench), так и на эксплантах, полученных из листьев трансгенного (rolB-GUS) табака (Nicotiana tabacum L., сорт Petit Havana). Наибольший эффект достигался при краткосрочной обработке эксплантов олигосахарином до добавления гормона. Оптимальное время предобработки зависело от выбранной модельной системы и составляло от 1-2 ч до 5-24 ч для сегментов гипокотилей гречихи и эксплантов из листьев табака, соответственно. Внесение OS-RG после ИУК не оказывало эффекта на количество корней, индуцируемых гормоном. Использование эксплантов из листьев трансгенного табака, содержащих репортерный ген GUS под контролем ауксин-индуцируемого промотора гена rolB, позволило выявить ответную реакцию эксплантов на гормон на ранних стадиях образования корней. Динамика GUS-активности после добавления ИУК характеризовалась наличием двух пиков. Гистологический анализ показал, что первый пик совпадает с образованием 4-5-слойных примордиев, а второй - с появлением практически сформировавшихся корней. Предобработка эксплантов из листьев табака OS-RG вызывала как увеличение ИУК-индуцируемой GUS-активности, так и ускорение ответной реакции, а именно смещение первого пика активности к началу культивирования; положение второго пика при этом не менялось. Таким образом, полученные данные указывают на то, что действие OS-RG предшествует действию гормона на ранних этапах ризогене-за. Обсуждаются возможные механизмы взаимодействия ИУК и олигосахарина в процессе формирования корней.
Ключевые слова: Nicotiana tabacum — Fagopyrum esculentum — олигосахарины — ИУК —трансгенныерастения — экспланты — корнеобразование — GUS-активность
DOI: 10.7868/S0015330315020128
ВВЕДЕНИЕ
Интерес к исследованиям механизмов ризоге-неза вытекает не только из важной роли корневой системы в поддержании роста и питания растительного организма, но и потому, что образование латеральных корней - удобная модель для изучения факторов, определяющих такую характерную особенность роста растений, как пластичность в развитии [1]. В зависимости от доступности воды и минерального питания растения оптимизируют архитектуру корня, главным образом за счет инициации и роста боковых корней разного порядка. К настоящему времени установлены стадии развития латеральных корней, включающие деление
Сокращения: 4-МУ - 4-метилумбеллиферон; МЗ/2 - среда Мурасиге-Скуга с половинным содержанием макросолей. Адрес для корреспонденции: Ларская Ирина Алексеевна. 420111 Казань, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Электронная почта: pzl@mail.ru
инициальной клетки, развитие примордия, формирование активной меристемы, появление и рост корня [2], а также выявлены биохимические, физиологические и гистологические события, непосредственно связанные с ризогенезом [1-3].
Среди основных ограничений для понимания механизма корнеобразования остается недостаток сведений об индукторах ризогенной программы. Ведущую роль в этом процессе отводят ауксину: установлена определяющая роль его градиента [1, 4]; идентифицированы компоненты его транспорта [3]; охарактеризовано большое число ИУК-индуцируемых генов [5]; показано, что изменение скорости синтеза ИУК у мутантных растений влияет на количество корней [4]. Тем не менее, до сих пор продолжается поиск других эндогенных факторов, участвующих в инициации ризогенеза. При этом основная часть выявленных к настоящему времени эффекторов функциони-
рует уже после запуска гормоном процесса корне-образования [6, 7]. Кроме того, рассматривая ауксин как ключевой стимул наиболее ранних событий инициации латеральных корней, включающих праймирование и получение отдельными клетками статуса клеток-основательниц [1-3], большинство авторов не учитывают события, которые происходят до начала действия гормона, и не рассматривают механизмы и сигналы, которые задействованы в выборе определенных клеток и формировании у них компетентности к ауксину.
Начиная с 80-х годов, появились данные об олигосахаринах — олигосахаридных фрагментах полисахаридов клеточной стенки, обладающих биологической активностью [8]. Выявлено большое количество олигосахаринов, отличающихся по составу, строению и физиологическому эффекту [9]. Некоторые из них участвуют в различных морфогенетических реакциях, что было продемонстрировано на ряде объектов [10-12]. Однако в основном исследовали эффекты оли-госахаринов, полученных путем химического синтеза или при гидролизе выделенных полисахаридов клеточных стенок. В нашей лаборатории была разработана методика получения биологически активных олигосахаринов из растительных гомогенатов без предварительного гидролиза полимеров клеточных стенок [13], что подтверждает существование этих регуляторных молекул in vivo. Среди выделенных олигосахаридных фракций одна (со степенью полимеризации ~ 10) обладала способностью стимулировать ИУК-индуцируе-мое корнеобразование на эксплантах из гипоко-тилей гречихи [14]. Хотя на настоящий момент сигнальная роль олигосахаринов уже не вызывает сомнения [9, 15], о механизмах их действия в опосредовании ИУК-индуцируемых процессов в растении известно немного.
Для исследования процесса корнеобразования нередко используют модельные системы (сегменты стеблей или листьев, тонкослойные эксплан-ты и пр.), у которых при определенных условиях происходит изменение программы развития отдельных клеток, что приводит к появлению так называемых адвентивных корней [16]. Образование адвентивных корней на модельных системах имеет общие черты с формированием боковых на основном корне, поскольку и те, и другие развиваются постэмбрионально из клеток, которые должны дедифференцироваться, чтобы дать начало новому органу. Сходство наблюдалось и в этапах развития корней, что было подтверждено в морфологических наблюдениях [1, 17], и в исследованиях экспрессии определенных корнеспеци-фичных генов [18]. Поэтому формирование адвентивных корней, продуцируемых на тканях растений, культивируемых in vitro, представляет собой подходящую систему для изучения корне-
образования при контролируемых условиях и влияния на этот процесс различных факторов.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в изучении ризогенеза [1-5, 19], еще нет ясной картины того, как многоступенчатый процесс развития корневой системы контролируется во время онтогенеза растения и какие механизмы координируют сложные ответы на многочисленные внешние и внутренние сигналы. Расшифровка этих механизмов требует дальнейших исследований, которые позволят более корректно описать процесс регуляции самых ранних стадий, а также осмыслить роль олигосахаринов как регу-ляторных молекул нового класса. Поэтому целью работы явилось изучение характера вовлеченности природного олигосахарина, стимулирующего ризогенез, в процесс ИУК-индуцируемого образования адвентивных корней.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследований служили сегменты ги-покотилей гречихи (Fagopyrum esculentum Moench), а также экспланты из листьев или гипокотилей трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum L., сорт Petit Havana), несущих конструкцию, состоящую из промотора rolB из Agrobacterium rhizogenes и репортерного гена GUS, кодирующего ß-глюкуро-нидазу, из Escherichia coli. Растения выращивали из семян, полученных в отделе биологических исследований Римского университета La Sapienza [11].
Для получения сегментов гипокотилей гречихи семена стерилизовали 10 мин в 2% растворе ги-похлорита натрия, а затем проращивали в течение 4 суток на агаризованной среде Мурасиге-Скуга с половинным содержанием макросолей (MS/2) [20]. Из средней части гипокотиля вырезали сегменты длиной 1 см, которые разделяли вдоль на две части, помещали срезом вниз в чашки Петри с жидкой средой MS/2 и культивировали в темноте при 25°C.
Для получения эксплантов из листьев табака растения выращивали при 25 °C и освещенности 20 Вт/м2 с 16-часовым фотопериодом из семян, предварительно простерилизованных 8 мин в 2% растворе гипохлорита натрия. Из листьев верхнего яруса 35-40-дневных растений удаляли среднюю жилку и вырезали сегменты размером 6 х х 6 мм. Экспланты помещали абаксиальной стороной вниз в чашки Петри в жидкую (для определения GUS-активности) или на агаризованную (для подсчета корней) среду MS/2. Культивирование эксплантов проводили в темноте при 25°C.
Для получения сегментов гипокотилей табака семена проращивали на безгормональной агаризованной среде MS/2 в течение 7 суток в термостате при 25°C. Из верхней части проростков вырезали отрезки длиной 6-8 мм, которые далее
культивировали в жидкой среде MS/2 в темноте при 25°C.
Среда MS/2 для всех модельных систем содержала 2% сахарозы, для агаризованной среды добавляли 0.8% агара. Все работы по выращиванию растений, приготовлению и культивированию эксплантов выполняли стерильно.
Для определения глюкуронидазной активности (GUS-активности) по 50 мг эксплантов из листьев табака или по 5 сегментов гипокотилей (длиной ~7 мм) растирали в ступке в экстрагирующем буфере (300 мкл), содержащем 50 мМ Na2HPO4, 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ Na2EDTA, 0.1% SDS, 0.1% Triton X-100, pH 7.0. Экстракты центрифугировали 3 мин при 7000 g. Измерение GUS-актив-ности проводили в том же буфере в присутствии 100 мкМ 4-метилумбеллиферилглюкуронида. Реакцию начинали добавлением 20 мкл экстракта и количество освободившегося в ходе реакции 4-ме-тилумбеллиферона (4-МУ) измеряли в течение 30 мин с 10-минутными интервалами на спектро-ф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.