МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 4, с. 585-591
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 575:574.2
ХАРАКТЕРИСТИКА И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА cry2А ИЗ МЕСТНОГО ИЗОЛЯТА Bacillus thuringiensis#
© 2015 г. R. Manikandan*, A. Ramalakshmi, V. Balasubramani, V. Udayasuriyan
Centre for Plant Molecular Biology and Biotechnology, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatore-641 003, India
Поступила в редакцию 21.07.2014 г. Принята к печати 08.09.2014 г.
Поиск и идентификация новых генов cry Bacillus thuringiensis (Bt) с более высокой инсектицидной активностью важны для создания трансгенных сельскохозяйственных растений, устойчивых к насекомым-вредителям. Охарактеризованы два новых местных изолята B. thuringiensis. Проведен анализ типа колоний, кристаллических включений и токсичности в отношении Helicoverpa armigera Hubner и Spodoptera litura Linn. Скрининг генов cry2A в двух новых изолятах Bt — T30 и T48, с помощью ПЦР со специфическими для семейства генов cry2A праймерами выявил эти гены только в изоляте Т30. Дальнейший скрининг, проведенный с тремя разными парами праймеров, специфичных для генов cry2A, выявил гены cry2Aa, cry2Ab и cry2Ac в обоих изолятах. Открытую рамку считывания (ORF) cry2A изолята Т48 (~1.9 т.п.н.) амплифицировали и клонировали в Т/А-векторе (~2.8 т.п.н.). Все полученные трансформанты Escherichia coli содержали только ген cry2Aa. Сравнение нуклеотидной последовательности гена cry2Aа (~1.9 т.п.н.) Т48 показал, что она на 99% идентична уже известному голотипу cry2Aa1. Выведенная аминокислотная последовательность Cry2Aa изолята Т48 отличается от голотипической последовательности Cry2Aa1 заменой только одного остатка.
Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, ген cry2A, клонирование, секвенирование.
CHARACTERIZATION AND CLONING OF cry2A GENE FROM AN INDIGENOUS ISOLATE OF Bacillus thuringiensis#, by R. Manikandan*, A. Ramalakshmi, V. Balasubramani, V. Udayasuriyan (Centre for Plant Molecular Biology and Biotechnology, Tamil Nadu Agricultural University, Coimbatore-641 003, India; *e-mail: bioinba@gmail.com). The discovery of novel cry genes of Bacillus thuringiensis (Bt) with higher toxicity is important for the development of transgenic Bt crops for resistance against target pest. Two new indigenous isolates of Bt were characterized for their colony type, crystal inclusion and toxicity analysis with Helicoverpa armigera Hubner and Spodoptera litura Linn. Screening of cry2A genes from two new isolates of Bt, T30 and T48 by PCR with cry2A family primers showed the presence of cry2A genes in the isolate T30 only. Further screening of the new isolates of Bt with three different cry2A gene specific primers showed the presence of cry2Aa, cry2Ab and cry2Ac genes in both the new Bt isolates. The cry2A open reading frame (orf) of Bt, T48 (~1.9 kb) was amplified and cloned in a T/A vector (~2.8 kb). All the Escherichia coli transformants were showed only cry2Aa gene. Comparison of nucleotide sequence data generated from the cry2Aa (~1.9 kb) gene showed 99% homology and one amino acid variation when in comparison with its holotype sequence of Cry2Aa1.
Keywords: Bacillus thuringiensis, cry2A gene, cloning and sequencing.
DOI: 10.7868/S0026898415040114
Bacillus thuringiensis (Bt) более 40 лет успешно используется в качестве биоинсектицида, представляя собой уникальный, специфический и эффективный инструмент для контроля численности широкого круга насекомых-вредителей. Bt — хорошо изученная грамположительная спорообразую-щая почвенная бактерия, в клетках которой в стационарной фазе роста формируются параспо-ральные инсектицидные кристаллические белки.
#Текст представлен авторами на английском языке.
* Эл. почта: bioinba@gmail.com
Кристаллы содержат один или несколько белков Cry (S-эндотоксинов), токсичных для насекомых отрядов Lepidoptera, Diptera и Coleoptera, а также некоторых нематод, клещей и простейших [1—4]. Однако при крупномасштабном культивировании трансгенных растений существует угроза развития у насекомых устойчивости к Bt [5, 6], поэтому при получении трансгенных растений второго поколения необходимо использовать комбинации новых инсектицидных генов [7, 8]. Выделение новых штаммов Bt и характеристика генов инсектицидных белков позволит выявить
новые гены, продукты которых обладают большей токсичностью, и создать альтернативный путь для преодоления возникающей в популяциях насекомых устойчивости к используемому в настоящее время ограниченному числу продуктов генов cry.
С целью идентификации новых генов cry из различных источников, включая почву [9], зернохранилища [10], филлосферы [11] и другие [12], выделяют новые штаммы Bt. Удобным методом быстрого и одновременного скрининга штаммов Bt с целью их классификации и предсказания инсектицидной активности является ПЦР. ПЦР вместе с другими методами, такими как ПДРФ, определение нуклеотидных последовательностей генов, электрофоретический, иммунологический и хроматографический анализ белков Cry и тестирование их токсичности для насекомых используют для идентификации новых инсектицидных белков [13]. К настоящему времени обнаружено более 500 различных генов cry, которые были классифицированы на 73 группы (Cry1—Cry73) [14]. Клонирование генов дает возможность экспресси-ровать гены cry в штаммах Bt или Escherichia coli, которые не содержат кристаллов, и определять инсектицидную активность их белковых продуктов.
В представленной работе охарактеризованы гены cry2A из местного изолята Bt. Проанализирована морфологии кристаллов, проведен электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (SDS-ПААГ), определена первичная структура и биологическая активность в отношении Lepidoptera.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы и плазмиды. Два местных штамма Bt (T30 и T48) и референтный штамм Bt (местный штамм 14r1) получены из коллекции штаммов Bt лаборатории биотехнологии Bt Центра молекулярной биологии и биотехнологии растений Сельскохозяйственного университета Та-милнад (Коямпуттур, Индия). Вектор pTZ57R\T для E. coliполучен от "Fermentas".
Характеристика местных изолятов Bt. Изоляты Bt, высеянные на чашки с агаром T3, инкубировали при 30°C в течение 2—3 дней. Анализировали морфологию отдельных колоний, выросших на Т3-агаре. Новые изоляты растили в среде Т3 до лизиса 90% клеток, окрашивали 0.133% Coomas-sie brilliant blue G250 в 50%-ной уксусной кислоте и анализировали морфологию кристаллов в световом микроскопе. Смесь спор и кристаллов выделяли из двух новых изолятов Bt и референтного штамма HD1 согласно Laemmli [15]. Белки изолятов Bt T30 и T48 разделяли с использованием электрофореза в SDS-ПААГ с 9%-ным разделяющим гелем [15]. Токсичность новых изолятов Bt в отно-
шении Helicoverpa armigera и Spodoptera litura анализировали согласно [16].
Амплификация ДНК Bt с помощью ПЦР. Суммарную ДНК выделяли из штаммов T30 и T48 Bt согласно. [17] и использовали в качестве матрицы для ПЦР. Геномную ДНК референтного штамма 14r1 использовали в качестве положительного контроля. Для скрининга генов семейства cry2A в изолятах Bt использовали набор универсальных праймеров (BD2UF, BD2UR). Ожидалось, что эти праймеры будут амплифицировать внутренний участок, специфичный для генов семейства cry2A. Скрининг подсемейства генов проводили, используя специфические прайме-ры [18] ^бл. 1). Открытую рамку считывания (ORF) эндотоксина T48 амплифицировали, используя набор праймеров для клонирования (2AFS и 2ARS).
ПЦР проводили в термоциклере Эппендорф в 25 мкл реакционной смеси, содержащей геномную ДНК Bt (30 нг), 2.5 мкл 10х ПЦР-буфера (10 мМ Tрис-Ha pH 9.0, 50 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2), 75 мкМ каждого из четырех dNTP, по 50 нг прямого и обратного праймеров и 0.5 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Проводили 30 циклов ПЦР в следующих условиях: денатурация 94°C, 1 мин; отжиг 0.45 мин при температуре, зависящей от прайме-ров, используемых для амплификации генов cry2A, cry2Ab, cry2Ac и cry2Ad; достройка — 72°C, 2 мин. Заключительную достройку проводили при 72°C в течение 7 мин. В случае гена cry2Aa — 62°C, 0.45 мин;
Клонирование ORF cry2A местного изолята
T48 Bt. Для амплификации гена cty2A размером ~1.9 т.п.н. из геномной ДНК изолята Bt T48 использовали праймеры 2AFS и 2ARS, соответствующие 5'- и 3'-концевым участкам ORF cry2A. Элюированные из геля продукты ПЦР гена cry2A (~1.5 т.п.н.) изолята T48 лигировали с T/A-векто-ром (pTZ57R\T "Fermentas") в соответствии с инструкцией изготовителя. Лигазной смесью трансформировали клетки E. coli стандартным методом
[19]. С целью проверки наличия вставок гена cry2A в изоляте T48 проводили скрининг колоний трансформированных клеток с помощью ПЦР с ген-специфичными праймерами.
Секвенирование рекомбинантных плазмид. Плаз-мидные ДНК выделяли из трансформированных клеток E. coli, нуклеотидную последовательность вставок, содержащих ген cry2A изолята Bt T48, определяли на автоматическом секвенаторе ("Ist Base", Сингапур). Поиск гомологий нуклеотидной последовательности проводили с помощью программы BLAST NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/Blas)
[20]. Выведенную аминокислотную последовательность получали с использованием программы BioEdit.
B
C
C
B
B
В — бипирамидальные В — бипирамидальные В — бипирамидальные
кристаллы кристаллы кристаллы
С — кубические кристаллы С — кубические кристаллы
Рис. 1. Микрофотографии спорулирующих культур двух местных изолятов Bacillus thuringiensis. a — Кристаллы референтного штамма Bt kurstaki HD-1. б — Кристаллы нового изолята T30 Bt. в — Кристаллы изолята Т48 Bt.
а
в
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Характеристика изолятов Bt
Анализ морфологии колоний новых изолятов Bt на чашках Петри с агаром T3 показал, что T30 формирует колонии мукоидного типа, а T48 — колонии типа яичницы. Кристаллы в новых изоля-тах T30 и T48 имеют бипирамидальную форму, кубическую и бипирамидальную форму соответственно (рис. 1). При SDS-ПААГ-электрофорезе белок из изолята T30 дает две полосы — 135 и 65 кДа, а из изолята T48 — только полосу 135 кДа (рис. 2). Анализ токсичности для личинок H. armigera и S. lit-ura в биотесте с искусственным кормом пок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.