ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА, 2015, том 41, № 4, с. 119-122
УДК 612.014:612.015.1-112-053.1
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАНОСВЯЗАННОГО ПУЛА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЛЕЙКОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ МУЖЧИН
РАЗНОГО ВОЗРАСТА
© 2015 г. О. Ю. Федоренко1,2, Н. А. Бохан1, С. А. Иванова1,2
1ФГБУ "Научно-исследовательский институт психического здоровья" СО РАН, Томск 2Национальный исследовательский Томский политехнический университет
E-mail: f_o_y@mail.ru Поступила в редакцию 23.04.2014 г.
Исследование изоформ лактатдегидрогеназы (ЛДГ) лейкоцитов у здоровых мужчин разного возраста выявило снижение мембраносвязанного пула ЛДГ-1 и ЛДГ-4 у 40-летних мужчин по сравнению с 20-летними. Полученные результаты свидетельствуют о возрастном сокращении резервного депонированного пула отдельных изоформ ЛДГ.
Ключевые слова: лактатдегидрогеназа, лейкоциты, мембраносвязанный пул, возрастные особенности.
DOI: 10.7868/S0131164615030030
Углеводный обмен определяет основной энергетический гомеостаз организма. Наличие тесных реципрокных связей между нервной, эндокринной и иммунной системами позволяет считать состояние энергетического метаболизма лейкоцитов адекватным отражением системного энергетического гомеостаза [1—3]. Основным энергетическим источником для клеток белой крови является глюкоза [4]. Находясь на развилке путей метаболизма углеводов, лактатдегидроге-наза (ЛДГ) участвует не только в регуляции тонко сбалансированного катаболизма и анаболизма, анаэробного и аэробного гликолиза, но и экспрессии генов [5, 6].
Значительную роль в регуляции активности ЛДГ играет адсорбционный механизм, то есть обратимое связывание с мембранами клеток [7—9]. Продуктивным способом изучения мембраносвязанного пула белков in vitro является использование методов молекулярной энзимологии с одновременным тестированием активности ферментов после воздействия различных сур-фактантов. Это позволяет получить дополнительную существенную информацию об их структурно-функциональном и топографическом состоянии, которая является недоступной в рамках традиционной клинической биохимии [5, 10].
Целью настоящей работы явилось исследование мембраносвязанного пула изоформ ЛДГ лейкоцитов крови у здоровых мужчин разного возраста.
МЕТОДИКА
Проведено обследование 60 здоровых мужчин. Первую группу составили 36 мужчин в возрасте от 18 до 24 лет (средний возраст 22.0 ± 0.5 года). Во вторую группу вошли 24 мужчины в возрасте от 30 до 58 лет (средний возраст 44.0 ± 1.5 года).
Описание подготовки лейкоцитарных проб опубликовано ранее [11]. Далее пробы инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Одна из проб тер-мостатировалась без дополнительной обработки, а в другие добавляли сурфактанты: тритон N-101 (5%), лауроилсаркозинат натрия (ЛСН) (0.05, 0.1 и 0.2%) и додецилсульфат натрия (ДСН) (0.02, 0.05 и 0.1%). Данные концентрации сурфактантов были предварительно подобраны экспериментальным путем и выбраны как наиболее информативные для изучения мембраносвязанного пула индивидуальных изоформ ЛДГ. Затем проводили электрофоретическое разделение белков в вертикальных пластинах полиакриламидного геля с применением прерывистой буферной системы. Для выявления ЛДГ гель инкубировали 30 минут в темноте при 37°С в 50 мл 0.05 М трис-HCl (рН 8.0) буфера, содержащего 75 мг лактата натрия, 10 мг NAD+, 5 мг нитросинего тетразолия и 2.5 мг феназинметасульфата. После этого гель фиксировали в 7% уксусной кислоте и уровень ферментативной активности изоформ ЛДГ определяли in situ. Полученные треки с изоформами спектрофотометрировали на приборе АКИ-Ц-01 при длине волны 492 нм. Оценку распределения (%) цитозольной активности изоформ ЛДГ в лей-
Таблица 1. Влияние 5% тритона N-101 на активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) лейкоцитов у здоровых мужчин разного возраста (% от необработанной пробы)
Изоформы Группа 1 Группа 2 Р
ЛДГ-4 296.61 ± 35.25 302.08 ± 24.14 0.896
ЛДГ-3 148.32 ± 7.36 149.55 ± 7.73 0.909
ЛДГ-2 115.58 ± 8.64 113.80 ± 6.05 0.872
ЛДГ-1 124.81 ± 7.45 103.78 ± 3.59 0.013
Примечание: Здесь и в табл. 2 и 3: группы 1 и 2 — здоровые 20-летние и 40-летние мужчины соответственно.
коцитах проводили в отсутствие поверхностно активных веществ. Действие детергентов на изо-формы выявляли по повышению их активности, происходящей за счет перехода фракций ЛДГ из связанного с мембранами пула (депо) в раствор, или по угнетению функции фермента вследствие его дезинтеграции. Полученные результаты выражали в процентах от активности соответствующей необработанной изоформы ЛДГ, принятой за 100%, которые, по сути, являлись единицами количественного выражения активности ЛДГ.
Проверку на нормальность распределения проводили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Статистическую обработку данных проводили с помощью ¿-критерия Стьюдента и фи-преобразования Фишера. В таблицах результаты представлены в виде средних арифметических, в качестве интервалов погрешностей приведены стандартные ошибки средних арифметических (М ± т).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В лейкоцитах периферической крови всех обследуемых без воздействия сурфактантов выявлялись четыре (ЛДГ-1-ЛДГ-4) из пяти изоформ ЛДГ. Тестирование активности изоформ ЛДГ путем воздействия детергентов с разными механиз-
мами действия позволило оценить величину мем-браносвязанного пула (депо) фермента.
По механизму действия неионный детергент тритон N-101 является наиболее мягким сурфак-тантом, поскольку он не изменяет заряд белковых молекул и поэтому не снижает функциональную активность цитозольных ферментов [12]. Воздействие 5% тритона N-101 проявилось увеличением активности всех изоформ по сравнению с необработанной пробой за счет растворения мембран и перехода мембраносвязанной фракции ЛДГ в раствор (табл. 1).
Выявлена достоверно более высокая активность ЛДГ-1 в группе 1 (124.81%) по сравнению с группой 2 (103.78%, р = 0.013) при отсутствии статистически значимых различий в отношении ЛДГ-2, ЛДГ-3 и ЛДГ-4. Отмечена наибольшая активность ЛДГ-4 (296.61% и 302.08%, р = 0.896). Поскольку тритон N-101 действует на липидный компонент мембран, полученные данные свидетельствуют о повышении тропности изоформ ЛДГ к липидному бислою мембран с увеличением количества М-субъединиц, образующих тетрамер ЛДГ.
Ионные детергенты додецилсульфат натрия (ДСН) и ^лауроилсаркозинат натрия (ЛСН) повышают растворимость всех мембран, непосредственно связываются с молекулами белка и меняют их изоэлектрическую точку за счет собственного заряда. Поэтому в зависимости от концентрации они могут увеличивать активность ЛДГ за счет растворения мембран и перехода фермента в раствор, или снижать ее за счет дезинтеграции четвертичной структуры белка [12, 13].
Активность всех изоформ ЛДГ после обработки 0.05% ЛСН в группе 1 возросла в большей степени по сравнению с группой 2 при отсутствии достоверной значимости. Более показательные результаты получены с использованием 0.1 и 0.2% концентраций этого детергента (табл. 2). При тестировании ЛДГ 0.1% ЛСН активность ЛДГ-1 в группе 1 (336.20%) достоверно выше по сравне-
Таблица 2. Влияние 0.1% и 0.2% ^лауроилсаркозината натрия (ЛСН) на активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) лейкоцитов у здоровых мужчин разного возраста (% от необработанной пробы)
Изоформы Концентрация ЛСН Группа 1 Группа 2 Р
ЛДГ-4 0.1% 0.2% 101.88 ± 16.82 0 73.30 ± 10.96 0 0.155
ЛДГ-3 0.1% 0.2% 106.97 ± 9.60 27.09 ± 5.77 96.47 ± 8.29 15.15 ± 2.20 0.424 0.072
ЛДГ-2 0.1% 0.2% 123.12 ± 12.56 56.72 ± 10.08 111.32 ± 6.48 30.71 ± 2.36 0.133 0.022
ЛДГ-1 0.1% 0.2% 336.20 ± 32.08 310.52 ± 27.49 250.14 ± 19.86 222.16 ± 23.79 0.026 0.022
ХАРАКТЕРИСТИКА МЕМБРАНОСВЯЗАННОГО ПУЛА ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 121
Таблица 3. Влияние 0.02% и 0.05% додецилсульфата натрия (ДСН) на активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) лейкоцитов у здоровых мужчин разного возраста (% от необработанной пробы)
Изоформы Концентрация ДСН Группа 1 Группа 2 Р
0.02% 211.84 ± 26.19 148.35 ± 8.01 0.016
ЛДГ-4
0.05% 235.85 ± 24.81 124.92 ± 14.23 <0.001
0.02% 117.39 ± 6.62 104.06 ± 2.60 0.091
ЛДГ-3
0.05% 139.80 ± 8.50 131.30 ± 9.86 0.516
0.02% 116.36 ± 9.01 95.59 ± 4.60 0.062
ЛДГ-2
0.05% 121.11 ± 7.54 115.80 ± 6.53 0.606
0.02% 177.49 ± 12.94 125.05 ± 9.12 0.002
ЛДГ-1
0.05% 251.70 ± 20.30 182.80 ± 13.82 0.007
нию с группой 2 (250.14%, р = 0.026). Статистически значимые различия в отношении ЛДГ-2, ЛДГ-3 и ЛДГ-4 не обнаружены (табл. 2).
В концентрации 0.2% ЛСН, наряду с активирующим влиянием на ЛДГ-1, ингибировал активность остальных изоформ (табл. 2). В случае изо-форм ЛДГ-1—ЛДГ-3 активность фермента достоверно выше в "первой" группе по сравнению со "второй": ЛДГ-1: 310.52% против 222.16% (р = = 0.022); ЛДГ-2: 56.72% против 30.71% (р = 0.022); ЛДГ-3: 27.09% против 15.15% (р = 0.072). Тестирование 0.1 и 0.2% М-лауроилсаркозинатом натрия выявило уменьшение резервного депонированного пула ЛДГ-1 у испытуемых группы 2 по сравнению с более молодыми испытуемыми группы 1.
Анализ результатов, полученных при использовании 0.02% ДСН, показывает заметно более высокую активность ЛДГ-1 (177.49% против 125.05%, р = 0.002) и ЛДГ-4 (211.84% против 148.35%, р = 0.016) наряду с недостоверным повышением активности ЛДГ-2 и ЛДГ-3 в группе 1 по сравнению с группой 2 (табл. 3).
Повышение концентрации ДСН до 0.05% усиливает его солюбилизирующие свойства, что отражено в табл. 3. Результаты, полученные при данном воздействии, обнаружили достоверно более высокую активность ЛДГ-1 (251.70% против 182.80%, р = 0.007) и ЛДГ-4 (235.85% против 124.92%, р < 0.001) в группе 1 по сравнению с группой 2. Использование 0.02 и 0.05% ДСН выявило более высокое содержание депонированного пула ЛДГ-1 и ЛДГ-4 в группе 1 по сравнению с группой 2.
Воздействие 0.10% ДСН оказывало ингибиру-ющее влияние на все изоформы обеих групп, кроме ЛДГ-1 в группе 2 (130.22%), что достоверно выше активности ЛДГ-1 в группе 1 (65.69%, р = = 0.018). Снижение активности ЛДГ-2 было достоверно больше выражено в группе 1 (7.90%) по сравнению с группой 2 (49.63%, р = 0.001). Аналогичный эффект отмечен и для ЛДГ-3 (1.93 и 27.66% соответственно, р < 0.001). Активность
ЛДГ-4 в группе 1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.