научная статья по теме ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ МУТАЦИИ СПЛАЙЗИНГА В ГЕНЕ СТЕРОИД-21-ГИДРОКСИЛАЗЫ Химия

Текст научной статьи на тему «ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ МУТАЦИИ СПЛАЙЗИНГА В ГЕНЕ СТЕРОИД-21-ГИДРОКСИЛАЗЫ»

Ш

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2011, том 37, № 6, с. 815-820

УДК 577.21

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ МУТАЦИИ СПЛАЙСИНГА В ГЕНЕ СТЕРОИД-21-ГИДРОКСИЛАЗЫ

© 2011 г. П. М. Рубцов*#, Е. Л. Игудин**, М. Ю. Пичугина**, П. В. Спирин*,

В. С. Прасолов*, А. Н. Тюльпаков***

*Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН,

Москва, 119991, ул. Вавилова, д.32; **Московский физико-технический институт (государственный университет), Москва ***ФГУ "Эндокринологический научный центр", Москва, 117036 Поступила в редакцию 25.04.2011 г. Принята к печати 18.05.2011 г.

Идентифицирована новая мутация в гене СУР21Л2, замена С на О в положении -7 акцепторного сайта сплайсинга интрона 2 (с.290-7С>0), вызывающая дефицит стероид 21-гидроксилазы. В системе экспрессии минигена СУР21Л2 в культивируемых клетках млекопитающих показано, что мутация с.290-7С>0 нарушает использование акцепторного сайта сплайсинга интрона 2 и приводит к сохранению интрона в мРНК.

Ключевые слова: врожденная гиперплазия коры надпочечников; ген СУР21Л2 человека; дефицит стеро-ид-21-гидроксилазы;мутация сплайсинга е.290-7С>С; экспрессия минигена.

ВВЕДЕНИЕ

Стероид-21-гидроксилаза (Р450с21) (КФ 1.14.99.10) — один из основных ферментов биосинтеза стероидных гормонов в коре надпочечников, относится к группе микросомных цитохромов Р450. Р450с21 участвует в биосинтезе глюкокортикоидов и минералокортикоидов, катализируя превращение 17-ОН-прогестерона в 11-дезоксикортизол и прогестерона в 11-дезоксикортикостерон. При дефиците Р450с21 нарушается продукция кортизола и альдо-стерона, что приводит к развитию разнообразных клинических проявлений. Дефицит Р450с21 - наиболее частая причина врожденной гиперплазии коры надпочечников (ВГКН) (OMIM 201910), лежащая в основе 90—95% случаев заболевания. Традиционно выделяют более тяжелые классические формы ВГКН: сольтеряющую и простую вирилизу-ющую, и легкую неклассическую форму ВГКН. Частота классических форм недостаточности стероид-21-гидроксилазы у новорожденных составляет в разных популяциях 1: 15000—1: 7000, частота неклассической формы у новорожденных в европеоидных популяциях - в среднем 1: 1000.

В геноме человека кодирующий Р450с21 активный ген CYP21A2 (NCBI Reference Sequence: NG_007941.2, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и высокогомологичный ему псевдоген CYP21A1P располо-

Сокращения: ВГКН - врожденная гиперплазия коры надпочечников; ОТ-ПЦР — обратная транскрипция с последующей ПЦР; Р450с21 - стероид-21-гидроксилаза.

#Автор для связи ( тел.: (499)135-99-74; эл. почта: гиЬх-ov@eimb.ru).

жены на расстоянии 30 т.п.о. друг от друга [2]. Деле-ции и генные конверсии, обусловленные рекомбинацией между геном и псевдогеном, являются основной причиной повреждений CYP21A2 (95% случаев недостаточности Р450с21) [3-6]. По механизму генной конверсии возникают 10 наиболее частых мутаций гена CYP21A2, общих для всех исследованных популяций. Реже встречаются мутации, не связанные своим происхождением с псевдогеном и характерные для отдельных семей и популяций [7-9]. Выявлено достоверное соответствие между генотипом и фенотипом при дефиците Р450с21, при этом клинические проявления определяются менее поврежденным аллелем CYP21A2 [9-11]. Мутации гена CYP21A2, вызываемый ими клинический фенотип и данные об остаточной активности фермента приведены в базе данных Human Cytochrome P450 (CYP) Allele Nomenclature Committee (информация доступна на сайте http://www.cypalle-les.ki.se/).

Для выявления инактивирующих мутаций в гене CYP21A2 используют разные подходы [7, 12-17]. Молекулярно-генетический анализ мутаций в гене CYP21A2, проведенный с использованием аллель-специфичной ПЦР, показал, что российская популяция не отличается по распространенности наиболее частых мутаций от других европейских популяций [18-21]. Ранее нами было идентифицировано несколько новых, не связанных своим происхождением с псевдогеном, миссенс-мутаций у больных с дефицитом Р450с21 и экспериментально подтверждено их инактивирующее действие с использова-

816 РУБЦОВ и др.

(а) Pcmv E2 IVS2 E3 pA

(б) сШссадсссссаШШШдсадАСА... м

сШссадсссссаШШд^дсадАСА... О.290-70>0 сШссадсссссад^ШШдсадАСА... О.290-13Д/0>0

Рис. 1. Минигены CYP21A2. (а) Общая схема минигенов CYP21A2: Pcмv — промотор цитомегаловируса, Е2 и Е3 — эк-зоны 2 и 3 гена CYP21A2, 2 - интрон 2 гена CYP21A2, и 3^ — донорный и акцепторный сайты сплайсинга ин-трона 2, рА — сайт полиаденилирования вируса SV40; (б) нуклеотидные последовательности акцепторных сайтов сплайсинга интрона 2 нормального гена CYP21A2 ^) и генов с мутациями с.290-7С>0 и с.290-13А/С>0. Нуклеотид-ная последовательность интрона показана курсивом, замены нуклеотидов выделены полужирным шрифтом.

нием систем экспрессии мутантных генов в клетках млекопитающих [22] и насекомых [23].

Наряду с нонсенс- и миссенс-мутациями гена CYP21A2 у больных ВГКН встречаются также мутации, нарушающие сплайсинг. В публично доступной базе данных мутаций генов человека HGMD (http://www.hgmd.cf.ac.uk/) представлено 8 таких мутаций, среди них — очень распространенная мутация в положении -13 интрона 2 (c.290-13A/C>G), происходящая из псевдогена и нарушающая использование нормального акцепторного сайта сплайсинга. В настоящей работе у больной классической сольтеряющей формой ВГКН идентифицирована новая мутация гена CYP21A2 (c.290-7C>G) и изучено ее влияние на сплайсинг интрона 2 с применением системы экспрессии минигена в культивируемых клетках человека. Установлено, что новая мутация нарушает использование акцепторного сайта сплайсинга, что приводит к сохранению интрона 2 в мРНК CYP21A2.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация мутации

Анализ гена CYP2M2 у больной с классической сольтеряющей формой дефицита Р450с21, проведенный методом аллель-специфичной ПЦР [7], не выявил известных мутаций. Прямое секвенирова-ние гена обнаружило гомо(геми)зиготную замену нуклеотида g.661C>G (нуклеотидная нумерация по гену) в районе акцепторного (3'-) сайта сплайсинга интрона 2. У матери пациентки мутация присутствует в гетерозиготном состоянии. ДНК отца была недоступна для анализа. Согласно номенклатуре, рекомендованной Human Genome Variation Society (http://www.hgvs.org/), эта замена нуклеотида обозначена нами как c.290-7C>G (нуклеотидная нумерация по кДНК). По классификации, принятой в базе данных аберрантных сайтов сплайсинга (ht-tp://www. dbass.org.uk) [24], это соответствует мута-

ции 1У82-7С>О. Замена С на О в положении -7 интрона 2 разбивает 9-звенный олигопиримидиновый блок, что может вести к нарушению сплайсинга. Для экспериментальной проверки влияния этой замены на сплайсинг интрона 2 мы решили сконструировать минигены CYP21А2, экспрессировать их в клетках человека и охарактеризовать продукты сплайсинга.

Конструирование минигенов CYP21А2

Для конструирования минигенов использовали плазмиду рЯК5, содержащую промотор цитомегаловируса (СМ^, полилинкер и сигнал полиаденилирования вируса SV40. Эта плазмида была ранее успешно применена для функционального анализа мутации сплайсинга в гене CYP11А1, кодирующем другой фермент стероидогенеза — холестеролдесмо-лазу, отщепляющую боковую цепь холестерина [25]. Для получения минигена с обнаруженной мутацией с.290-7С>0 фрагменты гена CYP2M2, содержащие часть экзона 2, интрон 2 и часть экзона 3, амплифи-цировали на матрице геномной ДНК пациентки, встраивали в плазмиду рЯК5 по сайту ЕсоМ и отбирали клоны с правильной ориентацией минигенов по отношению к промотору СМУ Для контроля эффективности сплайсинга аналогично сконструировали миниген CYP2M2 дикого типа и миниген с известной мутацией с.290-13А/С>0, нарушающей сплайсинг транскрипта гена CYP21А2. На рис. 1 представлена схема полученных минигенов и нуклеотидные последовательности акцепторных сайтов сплайсинга интрона 2.

Экспрессия минигенов CYP21А2 в клетках млекопитающих и анализ продуктов сплайсинга

Плазмидами, содержащими минигены CYP21А2, трансфицировали клетки НЕК293 человека. Через 48 ч после трансфекции клетки собирали и выделяли из них суммарную РНК, которую использовали в

ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОЙ МУТАЦИИ СПЛАЙСИНГА

817

M

— 500 п.о.

— 300 п.о.

— 200 п.о.

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР (дорожки 1, 3, 5) и ОТ-ПЦР (дорожки 2, 4, 6) на матрице суммарной РНК из клеток HEK293, экспрессирующих минигены CYP21A2 дикого типа (дорожки 1, 2) и с мутациями с.290-13Д/С>0 (дорожки 3, 4) и с.290-7С>0 (дорожки 5, 6). М - маркеры длины (GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder, "MBI Fermentas"). Стрелками слева показано положение продуктов ОТ-ПЦР, соответствующих по длине несплайсированной (а) и сплайсированной РНК (б).

качестве матрицы для проведения обратной транскрипции и последующей амплификации (ОТ-ПЦР) минигенов CYP21A2. Полученные фрагменты ДНК анализировали с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле (рис. 2). В качестве контроля использовали продукты амплификации миниге-нов CYP21A2, полученные на матрице суммарной РНК без обработки обратной транскриптазой. Как видно из рисунка, в образцах, не обработанных обратной транскриптазой (рис. 2, дорожки 1, 3, 5), выявлялись только продукты ПЦР, соответствующие

по длине несплайсированным транскриптам мини-генов (отмечены стрелкой а). Их образование объясняется присутствием следовых количеств ДНК в препаратах РНК. В продуктах ОТ-ПЦР (рис. 2, дорожки 2, 4, 6) интенсивность полос, соответствующих несплайсированным транскриптам, повышается. Кроме того появляются фрагменты ДНК, соответствующие по длине сплайсированным продуктам (стрелка б). В случае минигена с мутацией с.290-7С>0 такой фрагмент присутствует в следовых количествах (рис. 2, дорожка 6). Выявляются также фрагменты с промежуточной подвижностью. Как показал дальнейший анализ, они представляют собой гетеродуплексы, образованные сплайсиро-ванными и несплайсированными продуктами (данные не показаны).

Продукты ОТ-ПЦР, соответствующие по длине сплайсированному и несплайсированному вариантам транскриптов минигенов СУР21А2, выделяли из геля и секвенировали. Как и ожидалось, длинные фрагменты во всех случаях полностью соответствовали несплайсированным послед

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Химия»