ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 9, с. 1218-1225
ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^ ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17
ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ ЛИНИЙ Caenorhabditis elegans С ВЫСОКОЙ И НИЗКОЙ ТЕРМОТОЛЕРАНТНОСТЬЮ
© 2007 г. М. X. Гайнутдинов, А. X. Тимошенко, Т. М. Гайнутдинов, Т. Б. Калинникова
Институт экологии природных систем Академии наук Республики Татарстан, Казань 420087; факс: (843) 299-35-12; e-mail: tb-kalinnikova@nm.ru Поступила в редакцию 20.11.2006 г.
Окончательный вариант получен 20.02.2007 г.
Искусственным отбором дикой линии N2 по термостабильности локомоции и "естественным отбором в лаборатории" по теплоустойчивости фертильности в условиях переносимого повышения температуры среды получены линии C. elegans с низкой (НТ) и высокой (ВТ1, ВТ2 и ВТ3) термотолерантностью. Все эти линии являются новыми генетическими вариантами, появившимися в ходе эксперимента. У червей линий ВТ2 и ВТ3 повышены по сравнению с линией N2 верхний предел температур для размножения с 26°С до 27.5°С, термостабильность локомоции при 36°C и выживаемость при 37°C. Результаты работы показали, что адаптация C. elegans к повышению температуры может быть удобной моделью для изучения механизмов эволюции термотолерантности пойкило-термных Metazoa в лаборатории.
Температура тела пойкилотермных (экто-термных) животных из-за отсутствия у них системы терморегуляции изменяется вслед за изменением температуры окружающей среды. Поэтому организмы этих животных настроены в процессе эволюции на параметры их температурных ниш, которые варьируют в широких пределах в тропиках, средних и высоких широтах [1-4]. В связи с современным глобальным потеплением климата Земли, оказывающим сильное влияние на численность и географическое распространение многих видов животных, значительный интерес представляют вопросы о генетических механизмах адаптации популяций пойкилотермных животных к повышению температуры среды и эволюции термотолерантности этих животных. Во многом они остаются открытыми, несмотря на большое количество исследований генетики термотолерантности Drosophila [4]. Дополнительной к Drosophila модельной системой для изучения генетических механизмов термотолерантности и ее эволюции в лаборатории может быть свободно-живущая почвенная нематода Caenorhabditis е1е-gans, которая широко используется как удобный модельный организм в молекулярной [5-8], но не в популяционной генетике. Микроскопические размеры С. elegans (~1 мм), высокая скорость развития (3-4 дня) и размножения (>300 потомков для гермафродита) при простых условиях культивирования позволяют проводить эксперименты с большими по численности лабораторными популяциями С. elegans. Можно предполагать, что ЦНС является наиболее вероятной мишенью угнетающего и повреждающего действия высо-
кой температуры на организмы Metazoa [2]. По этой причине простая (из 302 нейронов) нервная система C. elegans, детально исследованная методами молекулярной биологии и генетики, безусловно удобна для проверки этого предположения [5, 9]. Отсутствие у C. elegans циркуляторной системы и органов внешнего дыхания значительно упрощает интерпретацию изменений признаков термотолерантности целого многоклеточного организма червя [10]. В данной работе путем отбора по термостабильности локомоции и "естественного отбора в лаборатории" по термостабильности фертильности в условиях адаптации популяций C. elegans к повышению температуры получены линии C. elegans с низкой термостабильностью локомоции и три линии червей с высокой теплоустойчивостью фертильности, локомоции и выживания. Показано, что эти линии являются новыми генетическими вариантами, появившимися в ходе эксперимента в результате спонтанных процессов возникновения этих вариантов (мутации и рекомбинация) или повышения частоты мутаций или рекомбинации повторяющимися тепловыми стрессами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Линии. В работе использована предоставленная Caenorhabditis Genetics Center Университета штата Миннесота дикая линия N2, отловленная в 50-х годах XX в. в Великобритании, и линии C. elegans, полученные в ходе работы в экспериментах с червями линии N2. Особей этих линий выращивали на пластинках агара в чашках Петри с ис-
%
Рис. 1. Результаты отбора по термостабильности локомоции С. elegans. 1 - отбор на повышение термостабильности локомоции; 2,3 - отбор на снижение термостабильности локомоции. По оси абсцисс - количество поколений, в которых прошел отбор. По оси ординат - среднее время появления ошибок моторной программы плавания при 36°С (1, 3) и 35°С (2), в % от линии N2.
пользованием стандартной среды выращивания нематод (СВН) [11], на которую предварительно высевали E. coli OP50.
Методы измерения термотолерантности C. elegans: 1) определение устойчивости локомоции червя к экстремальному, но переносимому организмом тепловому воздействию, показателем которой являлось среднее время появления ошибок моторной программы плавания (нарушения координации локомоторных мышц, необходимой для плавания в одном направлении), индуцированного сильным механическим стимулом (встряхивание пробирки с нематодами) при действии на организм постоянной высокой температуры 35°С или 36°С; 2) выживаемость C. elegans при 37°С, показателем которой являлось среднее время тепловой смерти (прекращение двигательных рефлексов, сохраняющееся через 2 ч после снижения температуры до 20°). Измерения термостабильности локомоции и выживаемости C. elegans проводили в термостатируемой водяной бане с точностью ±0.1°. В опыт брали 3-4-дневных особей, инкубированных индивидуально в пробирках с 1 мл СВН, из которой были исключены агар, пептон и холестерин; 3) определение способности C. elegans к размножению в условиях превышения физиологического оптимума температуры проводили в суховоздушных термостатах с популяциями из 10 червей, перенесенных на микропластинки агара (диаметр 3.5 см) с СВН и E. coli OP50, в трех повторностях.
Устойчивость C. elegans к окислительному стрессу определяли на микропластинках агара с E. coli по способности личинок IV возраста к выживанию в течение 4 дней в среде с 0.5 мМ параквата (метиловиологена), вызывающего появление реактивных метаболитов кислорода [7]. Каждые сутки всех живых червей переносили на свежие пластинки с агаром, в который вводили паракват.
Отбор. Искусственный отбор по термостабильности локомоции C. elegans проводили в двух направлениях при температуре 36°C, но отбор, направленный на снижение значения этого признака, начиная с 16-го поколения проводился при 35°C. Из 100-120 особей отбирали 10-15 особей с самой низкой или с самой высокой термостабильностью локомоции. "Естественный отбор в лаборатории" проводили по теплоустойчивости фер-тильности червей в условиях адаптации популяций C. elegans к повышению температуры среды, которую проводили на пластинках с агаром диаметром 100 мм и объемом 25 мл 14-дневными экспозициями к температурам 26.5, 27.0 и 27.5°C, каждая из которых повторялась 5 раз.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием ¿-критерия Стьюдента [12].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для получения контрастных (с низкой и высокой термотолерантностью) линий C. elegans проводили отбор в двух направлениях по термостабильности локомоции C. elegans, показателем ко-
Таблица 1. Термостабильность локомоции СавпогИаЬ-ditis elegans и выживаемость червей при действии экстремальной высокой температуры
Линия Среднее время появления ошибок моторной программы плавания, мин Выживание при 37°С, мин
35°С 36°С
N2 - 30.5 ± 2 59.6 ± 3
ВТ1 - 42.6 ± 3 79.5 ± 4
ВТ2 - 51.4 ± 3 91.2 ± 6
ВТ3 - 48.9 ± 2 85.4 ± 5
НТ 12.7 ± 3 - 27.1 ± 2
Примечание. В каждом варианте эксперимента даны средние значения для 20 особей червей 4-дневного возраста, выращенных при 20°С.
Таблица 2. Размножение червей линий N2, ВТ1 и НТ при 26°С
Численность личинок всех возрастов через 48 ч инкубации при 26°С
N2 ВТ1 НТ
Эксперимент № 1 85 ± 9 975 ± 83 78 ± 6
Эксперимент № 2 96 ± 7 959 ± 71 83 ± 8
Примечание. Каждый вариант эксперимента проводили в трех повторностях с 10 червями 4-дневного возраста, выращенных при 18°С.
торой являлось среднее время проявления ошибок моторной программы плавания червя, индуцированного сильным механическим стимулом. Эти ошибки проявлялись в нарушениях координации движений, необходимой для плавания в одном направлении после стимула. Отбор С. е1-egans по термостабильности локомоции ранее не использовался, но для получения линий Drosophi-1а с низкой и высокой термотолерантностью во многих работах проводился отбор не по выживаемости в условиях повреждающих организм тепловых воздействий, а по резистентности к "тепловому нокдауну" - полному, но обратимому обездвиживанию мушек после теплового воздействия [4]. Отбор на снижение термостабильности локомоции, проведенный в 12 поколениях, привел к небольшому, но достоверному снижению среднего времени появления ошибок моторной программы плавания С. elegans при 36°С, а продолжение этого отбора вызвало резкое снижение термостабильности локомоции после отбора в 15-16-м поколениях (рис. 1) с выходом на плато в 18-м поколении. После окончания отбора линию
С. elegans с низкой термостабильностью локомоции (НТ) выращивали при температуре 20°С. Как показано в табл. 1, у червей этой линии понижена по сравнению с червями исходной линии N2 не только термостабильность локомоции при 35 и 36°С, но и выживаемость при 37°С. Динамика результата отбора, направленного на снижение термостабильности локомоции, объяснима, если в ходе отбора в результате мутации или рекомбинации появился генетический вариант с очень низкой термотолерантностью, выявленный отбором в последующих поколениях. В соответствии с этим объяснением нам не удалось обнаружить в дикой линии N2 особей с такой низкой термостабильностью локомоции, как у червей линии НТ (табл. 1), хотя эксперименты проводили в течение года с большим количеством червей (>30000).
В результате отбора на повышение термостабильности локомоции (20 поколений) получена линия червей с высокой по сравнению с червями линии N2 термотолерантностью (ВТ1), но результат этого отбора оказался значительно ниже, чем рез
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.