ванный на количественной корреляции между значениями ингибирования перекисного окисления липидов и потенциалом полуволны (Еп/2). Ван Акер и сотр. [15] полагают, что определение двух параметров - Еп/2 и хелатирующей способности по отношению к ионам железа позволяет достаточно полно описать реакционную способность флавоноидов как антиоксидантов. Известно, что при исследовании антиоксидантной активности растительных полифенолов наиболее значимым фактором, определяющим ее величину, является рН среды. Растительные полифенолы попадают в организм как с пищей и напитками, так и в составе лекарственных препаратов и биологически активных добавок, диапазон рН которых варьирует в широких пределах от 3.0 до 7.0. Кроме того, метаболизм данных соединений в организме сопровождается изменением рН [19]. Именно влияние рН на поведение антиоксидантов рассматривается в большинстве работ, посвященных электрохимическому изучению этих веществ [20-23]. Очевидно, что антиоксидантная активность новых соединений как фармацевтического, так и пищевого назначения, не может быть предсказана без знания определенных закономерностей, обусловливающих их антиоксидантное действие. Попытки найти такой ключевой параметр, который позволил бы предсказывать антирадикальную эффективность соединения, остаются безуспешными. Основой для выбора такого параметра является установление взаимосвязи между химической структурой соединения и его антиоксидантной активностью. При использовании электрохимических методов основное внимание уделяется установлению корреляции между структурой, потенциалом окисления и антиоксидантной активностью индивидуальных антиоксидантов [23]. Однако в настоящее время такого рода исследования проведены лишь для узкого круга соединений, что, по нашему мнению, не позволяет экстраполировать полученные корреляции для всех представителей растительных полифенолов.
Цель работы - изучение электрохимического поведения растительных полифенолов - флавоноидов, гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот, и установление корреляции основных электрохимических параметров и антиоксидантной способности исследуемых соединений.
МЕТОДИКА
Материалы. Для приготовления рабочих растворов использовали химические вещества производства фирмы "Sigma" (США), а также реактивы марки х.ч. и о.с.ч. ("Реахим", Россия). АБТС (диаммониевая соль 2,2'-азинобис(3-этилбензотиа-золин-6-сульфоновой кислоты)), пероксодисуль-фат калия, 4-гидроксибензойная, 2,3-дигидрокси-
бензойная, 3,4-дигидроксибензойная, ванилиновая, галловая, сиреневая; феруловая, синаповая, кофейная и п-, о- и м-кумаровые кислоты, (±)-кате-хин, (-)-эпикатехин и дигидрокверцетин получены от фирмы "Sigma" (США), тролокс (синтетический аналог витамина Е, 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) от фирмы "Aldrich" (США).
Электрохимическое исследование. Циклические вольтамперограммы регистрировали с помощью потенциостата IPC-Pro 7.56 (Россия) с использованием трехэлектродной схемы, где в качестве рабочего электрода использовали пирографито-вый электрод диаметром 3 мм. Его чистили перед каждым определением алюминиевой пудрой в течение 3 мин; электрод сравнения - хлорсеребря-ный ("BAS", США), вспомогательный - платиновый электрод. Объем ячейки - 10 мл, скорость развертки напряжения - 25 мВ/с, циклические вольтамперограммы снимали в диапазоне потенциалов -200-+1200 мВ и -200-+600 мВ. Измерения проводились в 0.2 M калий-фосфатном буфере, рН 6.0, 0.05 M калий-цитратном буфере, рН 5.0, и 0.1 M цитрат-фосфатном буфере, рН 3.5. В качестве вспомогательного электролита, добавляемого в растворы для увеличения электропроводности, использовали 0.1 M KCl.
Концентрированные растворы полифенолов были приготовлены в 95%-ном этаноле. Для электрохимических измерений использовали растворы полифенолов в выше перечисленных буферах в конечной концентрации 1 мМ, за исключением раствора кверцетина, концентрация которого была 0.1 мМ. Эксперименты проводились при комнатной температуре (22 ± 1°С) в аэробных условиях. В расчетах использовали табличное значение концентрации кислорода в водном растворе 260 мкМ. Приведенные в статье потенциалы анодного пика Еп.а. были определены из кривых первого цикла циклических вольтамперограмм, а потенциал полупика (Е^) - как потенциал, при котором величина тока равнялась половине от максимума тока анодного пика.
Для определения корреляция потенциалов анодных пиков (Еп.а.) и ОАе фенольных соединений циклические вольтамперограммы регистрировались в 0.1 M цитрат-фосфатном буфере, рН 3.5, и 0.2 M калий-фосфатном буфере, рН 6.0.
Кинетические исследования взаимодействия полифенолов со свободным радикалом АБТС.
Радикал АБТС (АБТС ) получали по модифицированному методу Ре с сотр. [24]. Базовый раствор АБТС готовили в воде в концентрации 7 мM.
Для образования АБТС использовали пероксо-дисульфат калия в концентрации в смеси 2.45 мM. Смесь инкубировали в течение 12-16 ч при комнатной температуре до появления устойчивой
(a)
(б)
(в)
OH
OH
OH
OH
r5
OH
OH OH
bV
HO
HO
HO O
OH
OH
COOH
R2 R3
R4
CH=CHCOOH
R2
R3
HO O
3
R5 у R3 R4
Гидроксибензойная к-та R2 R3 R4 R5 Гидроксикоричная к-та
OH H H H о-Кумаровая
H OH H H м-Кумаровая
4-Гидроксибензойная H H OH H п-Кумаровая
2,3-Дигидроксибензойная OH OH H H
Протокатеховая H OH OH H Кофейная
Галловая H OH OH OH
H OCH3 OH H Феруловая
Ванилиновая H OH OH OCH3
Сиреневая H OCH3 OH OCH3 Синаповая
Рис. 1. Структурные формулы флавоноидов (а), гидроксибензойных (б) и гидроксикоричных кислот (в); 1 - (+) кате-хин, 2 - (-) эпикатехин, 3 - кверцетин, 4 - дигидрокверцитин.
окраски. Реакцию контролировали спектрофото-метрически при длине волны 734 нм на спектрофотометре Lambda 25 фирмы "Perkin Elmer" (США). АБТС не полностью окисляется пероксо-дисульфатом калия (стехиометрическое соотношение 1 : 0.5) [25] с образованием катион-радикала АБТС. В разработанной системе генерирования свободный радикал (СР) был стабилен в темноте при комнатной температуре в течение 48 ч. Контроль осуществляли спектрофотометрически, как описано выше. Полученный раствор радикала АБТС разбавляли водой до получения оптического поглощения 0.7 ± 0.02 на длине волны 734 нм. Расчет конечной концентрации АБТС в реакционной смеси проводили согласно закону Бугера-Лам-берта-Бера и она составляла ~47 мкМ (молярный коэффициент поглощения радикала АБТС = = 15000 М-1 см-1 при 734 нм [24]). В качестве стандарта использовали тролокс, растворенный в воде, в концентрации 5 мМ. Исходные растворы антиок-сидантов готовили в концентрации 5 мМ (4-гид-
роксибензойная, 2,3-дигидроксибензойная, 3,4-ди-гидроксибензойная и галловая кислоты в воде; ванилиновая, сиреневая, феруловая, синаповая, кофейная и п-кумаровая кислоты, (±)-катехин и (-)-эпикатехин в смеси 95%-ный этанол-вода в соотношении 2 : 8 (об./об.); дигидрокверцетин и кверцетин в 95%-ном этаноле) (рис. 1). Концентрации антиоксидантов в реакционной смеси составляли от 0.25 до 5 мкМ. Антиоксидантную активность исследуемых соединений определяли спектрофотометрически по убыли АБТС при длине волны 734 нм в течение 3 мин. Исследуемые антиоксиданты не имеют оптического поглощения при 734 нм, которое меняется в процессе их взаимодействия с АБТС , что позволяет корректно интерпретировать полученные данные.
Общая антиоксидантная емкость (ОАЕ). ОАЕ
полифенолов выражали в эквивалентах тролокса (TEAC, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) [5, 24, 25]. ТЕАС отражает способность водороддо-нирующих антиоксидантов восстанавливать ка-
Рис. 2. Калибровочная кривая расчета ОАЕ зависимости гибели катион-радикала АБТС (%) от концентрации (мкM) галловой кислоты (1) и тролокса (2).
тион-радикал АБТС. ТЕАС определяется, как концентрация раствора тролокса с такой антиоксидантной активностью, которая эквивалентна антиоксидантной активности исследуемого соединения при концентрации 1 мM. Практически TEAC рассчитывали следующим образом. Определяли снижение оптической плотности катион-радикала АБТС за 3 мин инкубации в реакционной смеси как с антиоксидантом, так и с тролоксом. Рассчитывали процент снижения оптической плотности от начального значения оптической плотности катион-радикала АБТС. Затем строили графики линейной зависимости гибели АБТС от концентрации антиоксиданта и тролокса (рис. 2). Отношение угла наклона этой кривой для антиоксиданта ( tg а1 ) к углу наклона для тролокса (tg а2 ) дает соотношение скоростей действия этих антиоксидантов при равных концентрациях. Поэтому численное значение отношения tg а1 / tg а2, отнесенное к 1 мкM антиоксиданта, дает эквивалентную по действию концентрацию тролокса, выраженную также в мкM.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установление количественной взаимосвязи между структурой растительных полифенолов и их биологической активностью базируется на большом числе параметров, определяющих их способность взаимодействовать с различными типами СР. К наиболее широко используемым параметрам следует отнести такие, как электрон-донорные свойства, депротонирование, стабильность радикала, химическая жесткость структуры, а также антиоксидантная активность и антиПРИКЛАДНАЯ БИОXИMИЯ И MИКРОБИОЛОГИЯ
I, мкА
-2 _4
-400 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400
E, мВ
Рис. 3. Циклические вольтамперограммы феруловой кислоты (1 мM) в 0.1 M цитрат-фосфатном буфере, рН 6.0 (1), 0.05 M калий-цитратном буфере, рН 5.0 (2), 0.2 M калий-фосфатном буфере, рН 3.5 (3). Вспомогательный электролит 0.1 M KCl. Скорость развертки 25 мВ/с.
радикальная эффективность. Попытки провести четкую корреляцию между химической структурой антиоксиданта и антиоксидантной активностью, основываясь на отдельных параметрах, к сожалению, не были успешными [23]. Очевидно, именно поэтому большинство авторов пытаются сопоставлять эти параметры не для всех полифенолов, а разделяя их на группы по структурным особенностям. Такой подход является ограниченным, поскольку процесс взаимодействие феноль-ных соединений со СР может быть многостадийным, сопровождаясь образованием промежуточных продуктов, которые могут вовлекаться в реакции взаимодействия и со СР и с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.