ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 5, с. 570-576
УДК 543.07:579.22:543.9
ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРОВ ПРИ ДВУХ СПОСОБАХ ИММОБИЛИЗАЦИИ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ
© 2012 г. М. Г. Зайцев*, В. А. Арляпов*, В. А. Алфёров*, А. Н. Решетилов**
*Тульский государственный университет, г. Тула, 300600 ** Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Московская обл., г. Пущино, 142290
e-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 30.09.2011 г.
Рецепторные элементы биосенсора на основе дрожжевых клеток Hansenulaрolymorpha NCYC 495 ln для определения этанола формировали, применяя два типа иммобилизации клеток: физическую адсорбцию на мембране из стекловолокон и пришивку на модифицированной нитроцеллюлозной мембране. Линейный диапазон определения этанола для биорецептора на основе дрожжей, адсорбированных на стекловолокне, составил 0.05—1.18 и 0.2—1.53 мМ для биорецептора на основе дрожжей, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране. Рецепторные элементы на основе сорбированных клеток обладали в 2.5 раза более высокой долговременной стабильностью. Время отклика было в 1.5 раза меньше у клеток, иммобилизованных с помощью ДЭАЭ-декстрана и бензохинона. Результаты определения этилового спирта биосенсорами на основе иммобилизованных адсорбцией и пришивкой клеток, а также стандартным ареометрическим методом имели высокую корреляцию (0.998 и 0.997 соответственно для двух методов иммобилизации). Полученные результаты свидетельствуют о возможности рассматривать описанные модели рецепторных элементов биосенсоров как прототипы опытных образцов для выхода в практику.
Одной из важных аналитических задач является экспресс-определение содержания низших спиртов в образцах. Это определение выполняется в различных технологических процессах, например, в бродильном производстве этилового спирта, в процессах культивирования микроорганизмов при использовании спиртов в качестве источника углерода, при контроле качества спиртных напитков, в фармацевтической промышленности, в клинико-токсикологических исследованиях [1]. Традиционные методы определения спиртов либо отличаются недостаточной точностью, либо трудоемки, дороги и характеризуются длительным временем анализа. Наиболее часто концентрацию спиртов определяют при помощи ареометра (спиртометра) или пикнометра [2, 3], однако этот метод не является селективным, так как наличие в растворе солей, углеводов и других примесей искажает результаты замера. Газовая хроматография, представляющая стандартный метод оценки спиртов [2, 3], является дорогостоящим методом и требует наличия квалифицированного персонала.
Актуальным направлением исследований является разработка метода анализа, который позволил бы упростить и удешевить процедуру определения указанных компонентов без потери точности и специфичности, а также обеспечить возможность их постоянного мониторинга в ре-
альных объектах. Перспективным подходом является развитие биосенсорной технологии [4]. К настоящему времени описано значительное количество моделей биосенсоров для детекции этанола и других алифатических спиртов, основанных на использовании ферментов [5, 6], в том числе алкогольоксидазы (АО). Источником АО, как правило, служат дрожжи Candida boidini, Pi-chia pastories, Pichia angusta, Hansenula polymorpha [7]. Наряду с использованием АО достаточно часто используются целые клетки микроорганизмов. Их применение имеет ряд преимуществ, к которым относятся существенное сокращение стоимости анализа, простота выполнения иммо-билизационных процедур и возможность осуществлять многостадийные реакции, при этом не требуется введения дополнительных экзогенных факторов [8]. Так, не претендуя на полноту рассмотрения, отметим некоторые особенности клеточных биосенсоров на основе клеток микроорганизмов. Иммобилизованные адсорбцией микроорганизмы Pichia angusta рассмотрены в работе [9]. В исследовании применена иммобилизация адсорбцией на стекловолоконную мембрану и использован способ получения различной селективности биосенсорной детекции за счет изменения условий культивирования биомассы. Многоканальный биосенсор на основе микроорганизмов Gluconobacter oxydans, Pichia angusta и Saccharomy-
ces bayanus позволял проводить анализ этанола в присутствии глюкозы, фруктозы и метанола [10]. Амперометрический биосенсор на основе клеток Candida tropicalis, иммобилизованных в желатин с использованием глутарового альдегида, имел широкий диапазон чувствительности и позволял проводить анализ этанола в диапазоне концентраций от 0.5 до 7.5 мМ [11]. Эти примеры, а также представленные в обзоре [8], свидетельствуют о возможности аналитического определения спиртов с помощью микробных биосенсоров. В настоящей работе представлялось важным ответить на вопрос о возможности иммобилизации именно микробных клеток на нитроцеллюлоз-ную мембрану и произвести сравнительный анализ параметров полученных рецепторных элементов биосенсоров для различных вариантов иммобилизации.
Цель работы — создание и изучение характеристик амперометрического биосенсора для анализа этанола на основе клеток дрожжей, иммобилизованных различными способами: адсорбцией и иммобилизацией на химически модифицированной поверхности нитроцеллюлозной мембраны.
МЕТОДИКА
Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием гальва-нопотенциостата IPC 2L ("Кронас", Россия), сопряженного с персональным компьютером под специализированным программным обеспечением IPC-micro той же фирмы для регистрации и обработки сигналов сенсоров. Средняя величина тока биосенсора в насыщенной окружающим воздухом дистиллированной воде, содержащей 9.2 мг/дм3 растворенного кислорода, при комнатной температуре составляла 30 нА при шуме преобразователя ±0.25 нА.
Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буфер, рН-7.6, концентрация солей — 60 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема 100-1000, 20-200 мкл ("GILSON", Франция). Измеряемым параметром (откликом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов (нА/с), определение проводили по изменению содержания кислорода в приэлектродном пространстве согласно биохимической реакции, катализируемой АО дрожжевых клеток:
RCH2OH + O2 ——— RCHO + H2O2.
После каждого измерения электрод промывали буферным раствором в течение 5-10 мин для восстановления концентрации кислорода в при-
электродном пространстве до первоначального уровня.
Культивирование дрожжевых микроорганизмов.
В работе были использованы 4 штамма метило-трофных дрожжей: Pichia angusta ВКМ Y-2559, Pi-chia angusta ВКМ Y-2518, Pichia angusta ВКМ Y-1397, Hansenula polymorpha NCYC 495 ln. Все штаммы были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (г. Пущи-но). Клетки выращивали на минеральной среде (г/л): (NH4)2SO4 - 2.5, MgSO4 - 0.2, K2HPO4 - 0.7, NaH2PO4 — 3.0, дрожжевой экстракт — 0.5 г, DL-лейцин — 0.17, глицерин — 8.3 мл, микроэлементы — 1 мл. Собранную биомассу хранили при 4°С.
Иммобилизация биоматериала. В работе использовали два способа иммобилизации микроорганизмов — на мембране из стекловолокон и на химически модифицированной с помощью ДЭАЭ-декстрана и бензохинона нитроцеллюлоз-ной мембране.
Иммобилизация микроорганизмов адсорбцией на мембране из стекловолокон Whatman GF/A.
Дрожжевые клетки ресуспендировали в калий-натрий фосфатном буферном растворе, рН-7.6, затем отбирали небольшое количество клеток (50—100 мг осажденной биомассы), разбавляли этим же буфером в соотношении 1 : 16 (по массе). Полученную суспензию наносили в количестве 5 мкл на фрагмент стекловолокнного фильтра GF/A ("Whatman", Великобритания) размером 3 х 3 мм2 и высушивали в течении 5—10 мин на открытом воздухе. Содержание осажденной биомассы в конечном биорецепторном элементе составляло ~30 мкг/мм2. Полученный биорецептор закрепляли на мембране кислородного электрода защитным нейлоновым колпачком.
Иммобилизация микроорганизмов с помощью ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллю-лозной мембране. 200 мкл раствора бензохинона (0.5 М) смешивали с 10 мг ДЭАЭ-декстрана, при этом бензохинон присоединялся к гидроксиль-ной группе мономера ДЭАЭ-декстрана (рис. 1).
Для дальнейшей работы отделяли систему ДЭАЭ-декстран—бензохинон (система А) от свободного бензохинона. Для этого использовали колонку с сефадексом G-25. Объем собранной фракции составлял 3 мл. На следующем этапе смешивали 400 мкл системы А и 100 мг осажденной биомассы. Суспензию тщательно перемешивали, при этом положительно заряженные аминогруппы ДЭАЭ-декстрана связывались с отрицательными зарядами на поверхности клеток, обусловленными наличием на поверхности карбонильных групп аминокислот.
После перемешивания в систему помещали несколько фрагментов нитроцеллюлозной мембраны размером 3 х 3 мм2 и оставляли в холодиль-
(a)
—O.
CH2
H
-а н
н
S. он н s о^-г о
O'
н
о.
сн3
I 3
сн2 I 2
сн2-сн2-кн®ес1
сн2 I 2
снз
(б)
о
^ /R^ Ж-
'W W R R' i
4R
он
^ R ^ ^ R ^ ^ R ^ ^-R-
R R R R I
о
о.
R
R
о -R-.
о
Рис. 1. Реакция присоединения бензохинона к ДЭАЭ-декстрану (а) и строение мономера ДЭАЭ-декстрана (б).
нике при +4°C на 24 ч Предложенная схема иммобилизации клеток на поверхность мембраны представлена на рис. 2.
Мембрану с иммобилизованными клетками отмывали калий-натрий фосфатным буфером, pH 7.6, и закрепляли на поверхности электрода. Конечную плотность клеток на мембране при выполнении иммобилизации по данной методике оценить достаточно сложно и данный вопрос при выполнении работы нами не ставился. Можно лишь отметить, что биомасса, которая исходно вводилась в систему А, выбиралась из условия, что если посадка будет произведена без потерь клеток, то их плотность на биорецепторном элементе должна была составлять величину, равную 30 мкг/мм2, т.е. как и предполагаемая плотность клеток на мембране GF/A при иммобилизации адсорбцией.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выбор дрожжевого штамма
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.