научная статья по теме ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРОВ ПРИ ДВУХ СПОСОБАХ ИММОБИЛИЗАЦИИ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Химия

Текст научной статьи на тему «ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРОВ ПРИ ДВУХ СПОСОБАХ ИММОБИЛИЗАЦИИ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 5, с. 570-576

УДК 543.07:579.22:543.9

ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЦЕПТОРНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ БИОСЕНСОРОВ ПРИ ДВУХ СПОСОБАХ ИММОБИЛИЗАЦИИ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ

© 2012 г. М. Г. Зайцев*, В. А. Арляпов*, В. А. Алфёров*, А. Н. Решетилов**

*Тульский государственный университет, г. Тула, 300600 ** Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Московская обл., г. Пущино, 142290

e-mail: anatol@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 30.09.2011 г.

Рецепторные элементы биосенсора на основе дрожжевых клеток Hansenulaрolymorpha NCYC 495 ln для определения этанола формировали, применяя два типа иммобилизации клеток: физическую адсорбцию на мембране из стекловолокон и пришивку на модифицированной нитроцеллюлозной мембране. Линейный диапазон определения этанола для биорецептора на основе дрожжей, адсорбированных на стекловолокне, составил 0.05—1.18 и 0.2—1.53 мМ для биорецептора на основе дрожжей, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране. Рецепторные элементы на основе сорбированных клеток обладали в 2.5 раза более высокой долговременной стабильностью. Время отклика было в 1.5 раза меньше у клеток, иммобилизованных с помощью ДЭАЭ-декстрана и бензохинона. Результаты определения этилового спирта биосенсорами на основе иммобилизованных адсорбцией и пришивкой клеток, а также стандартным ареометрическим методом имели высокую корреляцию (0.998 и 0.997 соответственно для двух методов иммобилизации). Полученные результаты свидетельствуют о возможности рассматривать описанные модели рецепторных элементов биосенсоров как прототипы опытных образцов для выхода в практику.

Одной из важных аналитических задач является экспресс-определение содержания низших спиртов в образцах. Это определение выполняется в различных технологических процессах, например, в бродильном производстве этилового спирта, в процессах культивирования микроорганизмов при использовании спиртов в качестве источника углерода, при контроле качества спиртных напитков, в фармацевтической промышленности, в клинико-токсикологических исследованиях [1]. Традиционные методы определения спиртов либо отличаются недостаточной точностью, либо трудоемки, дороги и характеризуются длительным временем анализа. Наиболее часто концентрацию спиртов определяют при помощи ареометра (спиртометра) или пикнометра [2, 3], однако этот метод не является селективным, так как наличие в растворе солей, углеводов и других примесей искажает результаты замера. Газовая хроматография, представляющая стандартный метод оценки спиртов [2, 3], является дорогостоящим методом и требует наличия квалифицированного персонала.

Актуальным направлением исследований является разработка метода анализа, который позволил бы упростить и удешевить процедуру определения указанных компонентов без потери точности и специфичности, а также обеспечить возможность их постоянного мониторинга в ре-

альных объектах. Перспективным подходом является развитие биосенсорной технологии [4]. К настоящему времени описано значительное количество моделей биосенсоров для детекции этанола и других алифатических спиртов, основанных на использовании ферментов [5, 6], в том числе алкогольоксидазы (АО). Источником АО, как правило, служат дрожжи Candida boidini, Pi-chia pastories, Pichia angusta, Hansenula polymorpha [7]. Наряду с использованием АО достаточно часто используются целые клетки микроорганизмов. Их применение имеет ряд преимуществ, к которым относятся существенное сокращение стоимости анализа, простота выполнения иммо-билизационных процедур и возможность осуществлять многостадийные реакции, при этом не требуется введения дополнительных экзогенных факторов [8]. Так, не претендуя на полноту рассмотрения, отметим некоторые особенности клеточных биосенсоров на основе клеток микроорганизмов. Иммобилизованные адсорбцией микроорганизмы Pichia angusta рассмотрены в работе [9]. В исследовании применена иммобилизация адсорбцией на стекловолоконную мембрану и использован способ получения различной селективности биосенсорной детекции за счет изменения условий культивирования биомассы. Многоканальный биосенсор на основе микроорганизмов Gluconobacter oxydans, Pichia angusta и Saccharomy-

ces bayanus позволял проводить анализ этанола в присутствии глюкозы, фруктозы и метанола [10]. Амперометрический биосенсор на основе клеток Candida tropicalis, иммобилизованных в желатин с использованием глутарового альдегида, имел широкий диапазон чувствительности и позволял проводить анализ этанола в диапазоне концентраций от 0.5 до 7.5 мМ [11]. Эти примеры, а также представленные в обзоре [8], свидетельствуют о возможности аналитического определения спиртов с помощью микробных биосенсоров. В настоящей работе представлялось важным ответить на вопрос о возможности иммобилизации именно микробных клеток на нитроцеллюлоз-ную мембрану и произвести сравнительный анализ параметров полученных рецепторных элементов биосенсоров для различных вариантов иммобилизации.

Цель работы — создание и изучение характеристик амперометрического биосенсора для анализа этанола на основе клеток дрожжей, иммобилизованных различными способами: адсорбцией и иммобилизацией на химически модифицированной поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

МЕТОДИКА

Биосенсорные измерения. Электрохимические измерения проводили с использованием гальва-нопотенциостата IPC 2L ("Кронас", Россия), сопряженного с персональным компьютером под специализированным программным обеспечением IPC-micro той же фирмы для регистрации и обработки сигналов сенсоров. Средняя величина тока биосенсора в насыщенной окружающим воздухом дистиллированной воде, содержащей 9.2 мг/дм3 растворенного кислорода, при комнатной температуре составляла 30 нА при шуме преобразователя ±0.25 нА.

Измерения выполнены в кювете объемом 5 мл. Для измерений использовали натрий-калиевый фосфатный буфер, рН-7.6, концентрация солей — 60 мМ. Раствор перемешивали магнитной мешалкой (200 об/мин). Пробы вводили автоматическими микропипетками переменного объема 100-1000, 20-200 мкл ("GILSON", Франция). Измеряемым параметром (откликом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов (нА/с), определение проводили по изменению содержания кислорода в приэлектродном пространстве согласно биохимической реакции, катализируемой АО дрожжевых клеток:

RCH2OH + O2 ——— RCHO + H2O2.

После каждого измерения электрод промывали буферным раствором в течение 5-10 мин для восстановления концентрации кислорода в при-

электродном пространстве до первоначального уровня.

Культивирование дрожжевых микроорганизмов.

В работе были использованы 4 штамма метило-трофных дрожжей: Pichia angusta ВКМ Y-2559, Pi-chia angusta ВКМ Y-2518, Pichia angusta ВКМ Y-1397, Hansenula polymorpha NCYC 495 ln. Все штаммы были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН (г. Пущи-но). Клетки выращивали на минеральной среде (г/л): (NH4)2SO4 - 2.5, MgSO4 - 0.2, K2HPO4 - 0.7, NaH2PO4 — 3.0, дрожжевой экстракт — 0.5 г, DL-лейцин — 0.17, глицерин — 8.3 мл, микроэлементы — 1 мл. Собранную биомассу хранили при 4°С.

Иммобилизация биоматериала. В работе использовали два способа иммобилизации микроорганизмов — на мембране из стекловолокон и на химически модифицированной с помощью ДЭАЭ-декстрана и бензохинона нитроцеллюлоз-ной мембране.

Иммобилизация микроорганизмов адсорбцией на мембране из стекловолокон Whatman GF/A.

Дрожжевые клетки ресуспендировали в калий-натрий фосфатном буферном растворе, рН-7.6, затем отбирали небольшое количество клеток (50—100 мг осажденной биомассы), разбавляли этим же буфером в соотношении 1 : 16 (по массе). Полученную суспензию наносили в количестве 5 мкл на фрагмент стекловолокнного фильтра GF/A ("Whatman", Великобритания) размером 3 х 3 мм2 и высушивали в течении 5—10 мин на открытом воздухе. Содержание осажденной биомассы в конечном биорецепторном элементе составляло ~30 мкг/мм2. Полученный биорецептор закрепляли на мембране кислородного электрода защитным нейлоновым колпачком.

Иммобилизация микроорганизмов с помощью ДЭАЭ-декстрана и бензохинона на нитроцеллю-лозной мембране. 200 мкл раствора бензохинона (0.5 М) смешивали с 10 мг ДЭАЭ-декстрана, при этом бензохинон присоединялся к гидроксиль-ной группе мономера ДЭАЭ-декстрана (рис. 1).

Для дальнейшей работы отделяли систему ДЭАЭ-декстран—бензохинон (система А) от свободного бензохинона. Для этого использовали колонку с сефадексом G-25. Объем собранной фракции составлял 3 мл. На следующем этапе смешивали 400 мкл системы А и 100 мг осажденной биомассы. Суспензию тщательно перемешивали, при этом положительно заряженные аминогруппы ДЭАЭ-декстрана связывались с отрицательными зарядами на поверхности клеток, обусловленными наличием на поверхности карбонильных групп аминокислот.

После перемешивания в систему помещали несколько фрагментов нитроцеллюлозной мембраны размером 3 х 3 мм2 и оставляли в холодиль-

(a)

—O.

CH2

H

-а н

н

S. он н s о^-г о

O'

н

о.

сн3

I 3

сн2 I 2

сн2-сн2-кн®ес1

сн2 I 2

снз

(б)

о

^ /R^ Ж-

'W W R R' i

4R

он

^ R ^ ^ R ^ ^ R ^ ^-R-

R R R R I

о

о.

R

R

о -R-.

о

Рис. 1. Реакция присоединения бензохинона к ДЭАЭ-декстрану (а) и строение мономера ДЭАЭ-декстрана (б).

нике при +4°C на 24 ч Предложенная схема иммобилизации клеток на поверхность мембраны представлена на рис. 2.

Мембрану с иммобилизованными клетками отмывали калий-натрий фосфатным буфером, pH 7.6, и закрепляли на поверхности электрода. Конечную плотность клеток на мембране при выполнении иммобилизации по данной методике оценить достаточно сложно и данный вопрос при выполнении работы нами не ставился. Можно лишь отметить, что биомасса, которая исходно вводилась в систему А, выбиралась из условия, что если посадка будет произведена без потерь клеток, то их плотность на биорецепторном элементе должна была составлять величину, равную 30 мкг/мм2, т.е. как и предполагаемая плотность клеток на мембране GF/A при иммобилизации адсорбцией.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор дрожжевого штамма

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком