МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2010, том 44, № 1, с. 107-119
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21; 578.821
ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ И ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ ВИРУСА ГЕПАТИТА С, СИНТЕЗИРОВАННЫХ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ С ПОМОЩЬЮ БАКУЛОВИРУСНОЙ СИСТЕМЫ
ЭКСПРЕССИИ
© 2010 г. С. Н. Белжеларская1*, Н. Н. Королева1, В. В. Попенко1, В. Л. Друца2, О. В. Орлова1, П. М. Рубцов1, С. Н. Кочетков1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119899
Поступила в редакцию 08.06.2009 г. Принята к печати 24.08.2009 г.
Три структурных белка: кор-белок С (core protein) и гликопротеины оболочки Е1 и Е2 — являются основными компонентами вириона вируса гепатита С (ВГС). Из-за отсутствия приемлемых для размножения ВГС клеточных культур до сих пор до конца не выяснены ни природа вирусной частицы, ни процесс ее сборки, ни роль структурных белков в морфогенезе вируса. Использование высокоэффективных гетерологичных систем экспрессии позволяет получать самособирающиеся, нереплицирующиеся, лишенные генома частицы, морфологически сходные с интактными вирионами. В бакуловирусной системе экспрессии в клетках насекомых нами получены индивидуальные структурные белки ВГС, уровень экспрессии которых достигал 25—35% от суммарного клеточного белка, гетеродимеры CE1 и Е1Е2, а также вирусоподобные частицы (ВПЧ). Показано, что рекомбинантные вирусные белки С, E1 и E2 подвергаются посттрансляционным модификациям, гликопротеины образуют нековалентный гетеродимер, а ВПЧ локализованы в мембранах эндоплазматического ретикулума (ЭР) зараженных клеток. Образование димеров Е1Е2 и псевдочастиц ВГС в клетках насекомых использовали для изучения влияния глико-зилирования гликопротеина Е1 на экспрессию и процессинг белков оболочки.
Ключевые слова: вирус гепатита С, структурные белки ВГС, вирусоподобные частицы, кор-подобные частицы, рекомбинантный бакуловирус, клетки насекомых, гликозилирование гликопротеинов.
CHARACTERIZATION OF HEPATITIS C VIRUS STRUCTURAL PROTEINS AND HCV-LIKE PARTICLES PRODUCED IN RECOMBINANT BACULOVIRUS INFECTED INSECT CELLS, by N. Beljelarskaya1*, N.N. Koroleva1, V. V. Popenko1, V. L. Drutza2,O. V. Orlova1, P. M. Rubtzov1, S. N. Kochetkov1 (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: belj@eimb.ru; 2Chemical Department of Moscow State University, Moscow, 119899 Russia). Three proteins, namely: "core" protein C and glycoproteins E1 and E2, are main structural proteins forming a hepatitis C virus (HCV) virion. The virus structure and assembly, a role of the structural proteins in virion morphogenesis remain unknown because of the lack of an efficient culture system for HCV to be grown in vitro. Using recombinant baculoviruses expressing HCV structural protein genes in insect cells the specific structural proteins at the level of25—35% relative to a common cell protein content, heterodimers of the glycoproteins, and HCV-like particles have been obtained. It has been demonstrated that recombinant proteins C, E1, and E2 go through the posttranslation modification, the glycoproteins form the non-covalent heterodimer, and HCV-like particles are located in endoplasmatic reticulum membrains ofinfected cells. An ability of the expressed proteins for forming E1E2 dimers and HCV-like particles was used for studying the role of E1 protein glycosylation upon expression and processing of the glycoproteins.
Key words: hepatitis C virus (HCV), HCV structural proteins, HCV-like particles, core—like particles, recombinant bac-ulovirus, insect cells, HCV glycoprotein glycosylation.
Вирусом гепатита С (ВГС) инфицировано более 3% населения во всем мире, причем у 70—80% больных наблюдается хроническая форма гепатита, у 20— 30% из них развивается цирроз печени и гепатоцел-
люлярная карцинома [1, 2]. Современные методы лечения ВГС нельзя считать идеальными, а профилактические вакцины для ВГС не созданы. Низкая эффективность репликации ВГС в культуре клеток,
Принятые сокращения: БОЕ — бляшкообразующие единицы; ВГС — вирус гепатита С; ВПЧ — вирусоподобные частицы; кл — клетка; монАТ — монокональные антитела; ФСБ — фосфатно—солевой буфер; ЭР — эндоплазматический ретикулум.
* Эл.почта: belj@eimb.ru
отсутствие адекватных клеточных культур и животных моделей затрудняют исследования, направленные на изучение его жизненного цикла, механизмов инфицирования и размножения. ВГС представляет собой оболочечный вирус, относящийся к роду Hep-acivirus семейства Flaviviridae. Вирусный геном, содержащий положительную цепь РНК, кодирует единственный полипротеиновый предшественник из 3010 аминокислотных остатков, который под действием клеточных и вирусных протеаз расщепляется на зрелые функциональные белки. На основании данных секвенирования генома ВГС подразделяют на 6 основных генотипов и более 15 подтипов
[2]. Десять белков ВГС в составе полипротеина-предшественника расположены в следующем порядке: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH, так что структурные белки вируса: С, E1 и E2 — расположены в N-концевой части полипротеина, а неструктурные белки — ближе к C-концу. В репликативный комплекс ВГС, скорее всего, входят все неструктурные белки, а также факторы клетки-хозяина. После расщепления клеточной сигнальной пептидазой из полипротеина-предшественника освобождаются структурные белки. Затем кор-белок подвергается действию пептидазы сигнального пептида и, являясь основным белком, связывается с РНК с образованием нуклеокапсида
[3], а белки Е1 и Е2 после гликозилирования при участии белков-шаперонов эндоплазматического ретикулума (ЭР) образуют две формы комплексов: гетеродимеры Е1Е2, формирующиеся за счет неко-валентных взаимодействий (ключевую роль в их образовании играет белок калнексин), и гетерогенные агрегаты, стабилизированные дисульфидными связями (в этом процессе участвует белок калретику-лин) [4]. Комплексы первого типа обеспечивают связывание вируса с клеткой и проникновение в нее, хотя тенденция к агрегации тоже характерна для гликопротеинов ВГС и, возможно, играет определенную роль в вирусном патогенезе.
Протеолитическое расщепление в некоторых сайтах полипротеина может быть неполным, например, белок Е2 может присутствовать в двух формах [5], а белок С в трех [6]. Кроме того, в процессе посттрансляционного созревания структурные белки ВГС могут находиться в различных гликозилиро-ванных формах. Существование нескольких форм одного и того же белка может отражать разнообразие его функций в инфекционном цикле вируса [7, 8].
Хотя с момента клонирования вирусной РНК в 1989 г. [9] в изучении генома ВГС и вирусных белков достигнут заметный прогресс, структурные особенности вириона остаются малопонятными, поскольку визуализация вирусных частиц в сыворотке крови и в тканях больных невозможна из-за низкого содержания в них вируса, а культивирование ВГС in vitro пока не налажено. Кроме того, в ограниченный спектр хозяев ВГС не входят мелкие животные, что исключает использование лабораторной модели
для размножения вируса. Таким образом, низкая эффективность репликации вируса в используемых культурах клеток, отсутствие адекватных клеточных культур и животных моделей обусловливают необходимость поиска альтернативных путей для изучения ВГС. Так, альтернативными моделями вириона могут быть вирусоподобные частицы (ВПЧ), которые образуются в клетках насекомых и млекопитающих при экспрессии генов структурных белков ВГС. ВПЧ — самособирающиеся, нереплицирующиеся, лишенные генома частицы, сходные по величине и форме с интактными вирионами, — успешно получают для лишенных оболочки вирусов, таких как вирус папиломы, ротавирус, вирус полиомы, а также для оболочечных ретровирусов [10—12]. Эти достижения являются результатом разработки высокоэффективных гетерологичных систем экспрессии генетического материала, например, на основе рекомбинант-ного бакуловируса. Впервые рекомбинантные частицы ВГС получены в 1998 г. Baumert и др. [13] в клетках насекомых с использованием рекомбинантных ба-куловирусов, несущих кДНК сегмента генома ВГС: 5' UTR-C-E1-E2-p7-NS2. Псевдочастицы ВГС, состоящие из структурных белков, могут быть использованы в качестве моделей вириона для изучения проникновения вируса в клетку и вирусного морфогенеза в целом. Клетки насекомых, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, представляют собой удобную систему для изучения процессов сборки вирусных частиц, а также для разработки прототипов вакцин на основании как ВПЧ, так и ре-комбинантных антигенов [15].
В этой работе, используя клетки насекомых Sf9, зараженные бакуловирусом, экспрессирующим структурные белки ВГС, мы исследовали функциональные характеристики структурных вирусных белков, их взаимодействие друг с другом, влияние гликозилирования гликопротеина Е1 на экспрессию и процессинг оболочечных белков ВГС.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные клетки, клеточные культуры и плазмиды. В работе использованы бактериальные штаммы E. coli DH5a и DH10Bac (Gibco-BRL, США), а также линия клеток Spodoptera frugiperda Sf9. Трансформацию бактериальных клеток плаз-мидными ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы-изготовителя (Amersham, США). Выделение и очистку ДНК-плазмид, расщепление рестрик-тазами, лигирование, электрофорез ДНК в агароз-ном геле и другие генно-инженерные манипуляции проводили по стандартным протоколам [16]. Реком-бинантные бакмиды получали и анализировали, как описано в инструкции [17]. Рекомбинантную бак-мидную ДНК вводили в клетки насекомых в присутствии реагента CellFECTIN.
Клетки насекомых культивировали в среде Sf-900 II, содержащей 10% эмбриональной сыворотки
крупного рогатого скота, при 27°С, используя основные технические приемы, разработанные Сам-мерсом и Смитом и описанные в инструкции [17]. Определение титра вируса, амплификацию реком-бинантного вируса, заражение клеток Sf9 рекомби-нантным бакуловирусом, а также анализ вирусной экспрессии проводили согласно той же инструкции.
По
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.