= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 579.862.1:577.113
ХАРАКТЕРИСТИКА УСТОЙЧИВОСТИ К АНТИБИОТИКАМ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ РОДА LACTOBACILLUS ИЗ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ МИКРОБИОМЫ ЧЕЛОВЕКА
© 2011 г. С. Г. Ботина*, 1, Е. У. Полуэктова1, А. А. Глазова1, Н. В. Захаревич1, Н. В. Коробан2, В. В. Зинченко2, М. М. Бабыкин3, О. Г. Жиленкова4, А. М. Амерханова4, В. Н. Даниленко1
1Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 2 Биологический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова 3 Международный учебно-научный биотехнологический центр МГУ имени М.В. Ломоносова 4Федеральное государственное учреждение науки Московский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, Москва Поступила в редакцию 20.05.2010 г.
У 13 штаммов лактобактерий рода Lactobacillus (4 штаммов L. plantarum, 4 штаммов L. helveticus, 3 штаммов L. casei/paracasei, L. rhamnosus и L. fermentum), выделенных из гастроинтестинальной микробиомы людей с территории бывшего СССР, определены уровни устойчивости к 15 антибиотикам различной природы: пенициллинам, аминогликозидам, макролидам, линкозаминам, тетрациклину, хлорамфени-колу и рифампицину. Все штаммы проявили относительную чувствительность к ампициллину, хлорам-фениколу, рифампицину, рокситромицину, эритромицину и азитромицину. При этом ни один штамм не был чувствителен ко всем использованным антибиотикам. Представители L. plantarum демонстрировали наиболее широкий спектр устойчивости: один штамм — к тетрациклину и трем аминогликозидам, три штамма — к тетрациклину и пяти аминогликозидам; один штамм — к клиндамицину и два штамма — к линкомицину. При этом два штамма L. plantarum отличались устойчивостью к бензилпенициллину, сопряженной с чувствительностью к другому ß-лактамному антибиотику, ампициллину. Очевидно, такая устойчивость не связана с активностью ß-лактамазы и может объясняться специфическим мутационным изменением одного из пенициллин-связывающих белков клеточной стенки. У штаммов L. helveticus, L. casei/paracasei, L. rhamnosus и L. fermentum выявлена перекрестная устойчивость к двум—пяти различным аминогликозидам. ПЦР-тест на детерминанты устойчивости к широко используемым в клинической практике антибиотикам — тетрациклину, хлорамфениколу и эритромицину, показал наличие гена tetMконъюгативного транспозона у L. casei/paracasei и у двух штаммов L. helveticus. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированных фрагментов генов устойчивости к тетрациклину tetM показал их высокую гомологию с генами tetM у Enterococcus faecalis и Streptococcus pneumoniae. Штаммы, несущие ген tetM, протестированы на наличие генов репликации и конъюгативного переноса плазмид молочнокислых лактобацилл. Установлено, что они содержат гены, идентичные или в значительной степени гомологичные генам rep и trsK плазмиды plca36 и гену rep плазмид pLH1 и pLJ1 молочнокислых лактобацилл. Вероятно, ген tetM не экспрессируется в клетках чувствительных к соответствующим антибиотикам штаммов. Сделано заключение, что исследованные штаммы лактобактерий не пригодны для прямого использования в качестве пробиотиков, поскольку могут служить источником генов устойчивости к антибиотикам в микробиоме человека.
Ключевые слова: Lactobacillus, молочнокислые бактерии, пробиотики, гастроинтестинальная микробиома человека, антимикробные препараты, резистентность, резистома, плазмиды, устойчивость к тетрациклину, хлорамфениколу, эритромицину, гены tetW/O, tetM, ermT, ermB, catTC, rep, trsK.
Многие бактерии содержат гены устойчивости к антибиотическим препаратам, ответственные за различные механизмы, которые позволяют бактериям преодолевать присутствие антибиотиков в окружающей среде [1]. Предполагается, что одной из функций генов антибиотикорезистентности может быть осуществление межклеточных (популяци-онных) связей в среде обитания микроорганизмов
* Автор для корреспонденции (e-mail: svetabotina@yahoo.com).
[2, 3]. Совокупность генов, кодирующих устойчивость к антимикробным препаратам недавно назвали резистомой ("^Моше") [4—6]. За длительный эволюционный период микроорганизмы развили различные стратегии преодоления большого количества экологических проблем, включая присутствие в среде обитания антибактериальных агентов. Устойчивые к антибиотикам микроорганизмы были выявлены больше чем 70 лет назад, до начала широкого клинического использования антибиотиков
[7]. С другой стороны, десятилетия их использования приводят к возникновению резистентности бактерий ко многим современным антибиотическим препаратам. До недавнего времени при исследованиях явления резистентности использовали изоляты патогенных бактериальных штаммов. Однако, по мнению ряда авторов, бактерии гастроин-тестинальной микробиомы (молочнокислые лакто-бациллы и бифидобактерии) могут являться резервуаром генов антибиотической резистентности, которые могут передаваться через гастроинтести-нальный тракт человека патогенным бактериальным штаммам, вызывающим различные инфекционные заболевания [8, 9].
Для лактобацилл характерно наличие природной высокой устойчивости к ряду антибиотических препаратов, особенно к ванкомицинам [10]. При изучении 500 изолятов молочнокислых бактерий из различных субстратов и ферментированных продуктов, 50% которых идентифицированы как лактобацил-лы, показано, что генетические детерминанты устойчивости к антибиотикам обнаруживались почти исключительно в бактериальных штаммах, выделенных из неферментируемых субстатов, в то время как бактерии, выделенные из промышленных продуктов, не были устойчивы к антибиотикам [11]. При типировании генов антибиотикорезистентно-сти у 34 штаммов лактобацилл, идентифицированных как Lactobacillus acidophilus, L. casei и L. del-brueckii subsp. bulgaricus, и бифидобактерий, выделенных из промышленных пробиотических препаратов и пищевых продуктов, оказалось, что все исследуемые штаммы были устойчивы к азтреонаму, циклосерину, каналицину, налидиксовой кислоте, полимиксину В, спектиномицину. Устойчивость к хлорамфениколу, гентамицину, линкомицину, мет-ронидазолу, неомицину, стрептомицину, тетрациклину и ванкомицину варьировала у исследуемых штаммов [12]. В другом, более детальном исследовании показано, что 115 штаммов лактобацилл видов L. paracasei и L. casei характеризовались природной устойчивостью к стрептомицину и гентамицину. 3 штамма L. paracasei, выделенные из сыра, авторами характеризовались как имеющие приобретенную устойчивость к тетрациклину и эритромицину. Эта устойчивость была связана с присутствием генов tetMили tetWи/или ermB [13]. Мы полагаем, что современные исследования биологической безопасности лактобацилл должны включать выявление наличия возможности передачи признака лекарственной резистентности. Изучение распространения генов антибиотикорезистентности у молочнокислых бактерий поможет лучшему пониманию роли молочнокислых бактерий в передаче признаков ан-тибиотикорезистентности и решению проблемы биологической безопасности стартовых и пробио-тических культур молочнокислых бактерий [8].
Цель настоящей работы — провести тестирование свойств устойчивости к антибиотикам и вы-
явить наличие генов, кодирующих антибиотико-резистентность к наиболее клинически распространенным антибактериальным препаратам потенциальных пробиотических бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробио-мы людей, а также определить потенциальную возможность переноса генов, кодирующих признаки устойчивости к антибиотикам.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и условия культивирования. В работе исследовали 13 штаммов бактерий рода Lactobacillus (из ГКНМ ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского), выделенных из содержимого кишечника здоровых людей. Список штаммов, использованных в работе, приведен в табл. 1. Физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики штаммов приведены в ранее проведенных работах [14, 15]. Культуры бактерий выращивали в жидкой и на ага-ризованной среде МРС ("HiMedia") в термостате при 37 ± 0.5°С в течение 24—48 ч. Выращивание бактерий на плотных питательных средах проводили в анаэростатах и с использованием газовых пакетов ("bioMerieux"), обеспечивающих атмосферу с 10% СО2.
Определение спектра чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам определяли диско-диффузным методом согласно методическим рекомендациям (МУК 4.2.1890-04) [16].
Выделение геномной ДНК проводили согласно методики [14].
Подбор праймеров для молекулярно-генетической характеристики штаммов лактобацилл. Праймеры для выявления у лактобацилл генов резистентности к антибиотическим препаратам были выбраны с помощью Online-программы NCBI/Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Были использованы аннотированные нуклеотидные последовательности генов устойчивости к антибиотикам L. reuteri, родственной лактобациллам бактерии Enterococcus faecalis, и бифидобактерий Bifido-bacterium thermophilum и B. longum. Единым параметром поиска для всех праймеров служила одинаковая температура плавления, равная 64°С (для 2 известных праймеров, температура плавления составляла 68 и 65°С). В качестве прямых праймеров к генам catTC, ermB, ermT и tetM использовали олигонуклео-тиды, являющиеся частью или перекрывающие часть одноцепочечных ДНК-зондов, с помощью которых была изучена встречаемость 90 генов устойчивости к антибиотикам у грамположительных бактерий, включая лактобациллы [17]. В пару к каждому прямому праймеру был подобран обратный прай-мер на расстоянии от 200 до 600 п.н. от прямого праймера (табл. 2). Для выявления с помощью ПЦР генов tetW и tetO, а также их гибридных вариантов tetW/32/O, tetO/W и tetO/W/32/O/W/O, наряду с
Таблица 1. Список штаммов, использованных в работе, информация о происхождении, номер депонированной нами последовательности гена 16S рРНК в GenBank NCBI
Видовая принадлежность штамма Название штамма Источник выделения Номер депонированной последовательности в GenBank NCBI
L. plantarum CS 396 Содержимое кишечника здорового взрослого человека, коллекция МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.