научная статья по теме ХАРАКТЕРИСТИКА ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГЛИКОЛИПИДА LENTINUS EDODES (BERK.) SING [LENTINULA EDODES (BERK.) PEGLER] Биология

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 4, с. 490-495

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 582.28:57.083

ХАРАКТЕРИСТИКА ВНЕКЛЕТОЧНОГО ГЛИКОЛИПИДА LENTINUS EDODES (BERK.) SING [LENTINULA EDODES (BERK.) PEGLER]

© 2008 г. О. M. Цивилева1, В. E. Никитина, О. E. Макаров

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов

Поступила в редакцию 26.06.2007 г.

При погруженном культивировании ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes секретирует гли-колипид, С3, ассоциированный с лектином. Гликолипид необычен для базидиомицетов как своей гликановой частью, представленной галактозой, так и составом липидного пула, включающим не-гидроксилированные короткоцепочечные жирные кислоты. Он представляет собой ö-галактопи-ранозу (15% С3 содержат сульфат-галактозу), ацилированную остатками октадекановой или нона-декановой кислот (28 и 72% от суммы соответственно) Данные физико-химического исследования гликолипида подтверждают его состав и строение. Предполагается, что гликолипид является регулятором активности лектинов.

Ключевые слова: Lentinus edodes, гликолипид, лектины высших грибов, внеклеточные гликопротеины.

Распространено мнение о том, что гликолипиды разных типов, секретируемые дрожжеподобными грибами, выполняют в первую очередь роль био-сурфактантов, то есть облегчают растворение и потребление клетками микроорганизмов органических гидрофобных веществ, присутствующих в среде [1]. В последние годы обнаружено, что эти гликолипиды обладают также и биологической активностью.

Секретируемые гликолипиды, обладающие фунгицидным действием против широкого спектра дрожжеподобных грибов, в том числе ряда видов, имеющих медицинское значение (Candida albicans, С. glabrata, С. viswanathii, Filobasidiella neoformans, Clavispora lusitaniae), обнаружены у дрожжей Pseudozyma fusiformata [2], P. flocculosa [3] и Crypto-coccus humicola [4]. Внеклеточный целлобиозоли-пид, содержащий 2,15,16-тригидроксипальмитино-вую кислоту, оказался фунгицидным агентом у дрожжей Sympodiomycopsis paphiopedili [5]. В 2007 г. опубликована информация о том, что целлобиозо-липид P. fusiformata, который, в отличие от гликолипида С. humicola, имеет гидроксикапроновую кислоту в качестве О-заместителя целлобиозы и дополнительную 15-ОН-группу в углеводородной цепи жирнокислотной части молекулы, более эффективно подавляет рост некоторых мицелиальных грибов по сравнению с целлобиозолипидом из С. humicola [1]. Следовательно, новые экспериментальные данные подтверждают важность деталей структуры эк-зогликолипидов для проявления ими биологической активности.

1 Адресат для корреспонденции (e-mail: tsivileva@ibppm. sgu.ru).

В 1991 г. впервые обнаружены фенолсодержа-щие гликолипиды у грибов [6]: оказалось, что в состав гликолипида из липидных фракций зигомице-та Blakeslea trispora, кроме жирных кислот и углеводной части, входит фенольная структура. Это внутриклеточный гликолипид, поэтому, вероятно, оснований для сравнения с экзогликолипидами в данном случае мало. Однако наиболее интересным нам показался тот факт, что углеводный компонент обнаруженного Коновой с соавт. [6] гликолипида представлен галактозой (аналогично С3). Фактором, стимулирующим синтез гликолипидов B. trispora вообще и фенолсодержащего галактозо-липида в частности, является, по наблюдениям тех же авторов, дефицит фосфатов в среде. Это позволило сделать вывод о том, что синтез галактозоли-пида, отличного от ранее известных гликолипидов наличием в его составе фенольной структуры, является одной из адаптивных реакций клеток В. trispora на недостаток экзогенных фосфатов [6].

О наличии лектинов у Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] (шиитаке) информация крайне ограниченна [7, 8], а данные о препаратах внеклеточных лектинов ксилотрофных базидиомицетов отсутствуют. После обнаружения, выделения и очистки экзолектинов L. edodes [9-11] представляло интерес выявить эндогенные регуляторы их биологической активности. Поскольку в литературе нет сведений о регуляторной активности гликолипидов в отношении лектиновой активности, соответствующий поиск изначально не проводился нами целенаправленно среди гликолипидов, и привел к положительным результатам лишь

в связи с обнаружением изменения активности лек-тинов при очистке.

В наших исследованиях была поставлена задача выделения, физико-химической характеристики внеклеточного гликолипида Ь. вйойв8, изучения его способности влиять на активность препаратов внеклеточных лектинов гриба.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использован штамм ЬвМтш ейойвъ Б-249 из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии МГУ. Культуру поддерживали на скошенном сусло-агаре. Посевным материалом для засева колб при глубинном культивировании служил вегетативный мицелий после 14 сут роста.

Жидкофазное культивирование проводили в периодическом режиме на синтетической среде, в состав которой входили О-глюкоза (50 мМ) и Ь-ас-парагин (10 мМ) для достижения соотношения углерод : азот - 15 : 1 [12].

Гемагглютинирующую активность в жидких средах определяли реакцией гемагглютинации с самопроизвольным оседанием эритроцитов, используя 2%-ную суспензию трипсинизированных кроличьих эритроцитов в серии последовательных разведений лектина. Титр гемагглютинации выражали как наибольшее разведение раствора, вызывающее агглютинацию эритроцитов [13].

При выделении внеклеточных лектинов Ь. edod.es Б-249 в качестве грубого белкового экстракта использовали культуральную жидкость гриба. К сконцентрированному в 10 раз фильтрату культуральной жидкости добавляли два объема ацетона. Выпавший при 4°С осадок отделяли от супернатанта. Супернатант освобождали от ацетона, высушивали при 30-32°С, остаток растворяли в воде, получая неочищенный раствор лектина Л2 [11]. Водный раствор Л2 пропускали через колонку (1.7 х 9 см) с Sephadex в-25, элюент вода. Выход белковых фракций регистрировали на приборе ИуюоМ S-II ("ЬКВ") при 280 нм. Активную по гемагглютинации фракцию подвергали гель-фильтрации на колонке (1.5 х 43 см) с Sephadex в-75, уравновешенной 0.1 М №С1.

Дальнейшую очистку лектинов Л1 и Л2 проводили с использованием ионообменной хроматографии. При нанесении активных гемагглютинирующих фракций, сошедших с колонки после гель-эксклю-зионной хроматографии, на колонку (1.0 х 16 см) с катионообменником Toyopearl СМ-650М большинство примесей связалось с носителем, тогда как очищенные лектины выходили со свободным объемом. Анионообменная хроматография указанных фракций, содержавших преимущественно Л1 или Л2, на

колонке (1.0 х 16 см) с Toyopearl DEAE-650M привела к полному разделению двух лектинов, выходивших с колонки при существенно различной ионной силе элюента.

Обессоленный водный раствор, содержавший в основном С3 и примеси Л2 после стадии очистки с использованием Sephadex G-75, высушивали при 30-32°С и экстрагировали модифицированным методом выделения липидов [14], включающим обработку сухого липидсодержащего вещества смесями метанол-вода-хлороформ в объемном соотношении (1 : 2 : 3), высушивание в токе азота или аргона.

Для определения содержания жирных кислот (ЖК) проводили экстракцию сухого остатка гекса-ном. Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии [15]. Метиловые эфиры ЖК разделяли на газожидкостном хроматографе "Биохром-1" на кварцевой капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0.2 мм) с неподвижной фазой SE-54. Использовали режим программирования температуры термостата колонки от 130 до 270°С со скоростью нагрева 4°С/мин. Температура испарителя 150°С, детектора 270°С. Газ-носитель - гелий, скорость потока 1.6 мл/мин.

Жирные кислоты идентифицировали по временам удерживания их метиловых эфиров. В качестве стандартов метиловых эфиров ЖК использовали набор Bacterial Fatty Acid Methyl Esters CP Mix ("Supelco"), а также в дополнение отдельные метиловые эфиры ЖК ("Sigma").

Состав углеводной фракции сухих образцов исследовали методом капиллярной газовой хроматографии на неподвижной фазе SE-54, газ-носитель гелий, в режиме программирования температуры от 150 до 280°С с предварительным получением си-лильных производных. Триметилсилильные эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием гексаметилдисилазана и триметилхлорсилана в пиридине [16].

Инфракрасные спектры регистрировали на приборе иК-Фурье спектрометр ФСМ 1201 в тонком слое вазелинового масла и гексахлорбутадиена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Используя экстракцию растворителями внеклеточного лектина Л2 L. edodes на промежуточной стадии его очистки, мы получили препарат (обозначенный нами С3), содержащий галактозу (выход 0.19%) и 2 жирные кислоты (выход 0.17%) С8 : 0 и C9 : 0 (28 и 72% от суммы соотВетстВенно).

Накопление в мицелии шиитаке короткоцепо-чечных жирных кислот, входящих в состав галакто-липида, происходит только на стадии формирования коричневой мицелиальной пленки и коррелирует с

резким повышением внеклеточной лектиновой активности в смывах с мицелия. При образовании недифференцированных плодовых тел на белом мицелии никакого повышения содержания в мицелии ЖК С8 : 0 или С9 : 0 и увеличения лектиновой активности не наблюдается. Более подробному описанию изменений жирнокислотного состава мицелия во взаимосвязи с лектиновой активностью культуры в процессе морфогенеза посвящена наша работа [17].

Можно высказать предположение о возможной роли С3 как одного из регуляторов активности внеклеточных лектинов. Кроме корреляции накопления компонентов С3 с увеличением лектиновой активности, о возможном участии гликолипида в регуляции этой активности говорят результаты других наших наблюдений. В смесях препаратов С3 + Л1 и С3 + Л2 при одинаковой массовой концентрации компонентов титр гемагглютинации возрастает в 8 и 16 раз соответственно (собственной гемагглюти-нирующей активности С3 не проявляет). Кроме того, в ходе процедуры очистки препарата Л2 удельная активность его проходит через максимум на промежуточной стадии, на которой Л2 связан с С3, а затем заметно снижается по мере дальнейшей очистки Л2.

При воздействии н

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.