ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2011, том 436, № 4, с. 559-562
УДК 547.241+577.122.3+632.952
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
ХИМИЧЕСКОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА МИКОТОКСИНОВ
© 2011 г. Член-корреспондент РАН Р. М. Хомутов, В. Г. Джавахия, Е. Н. Хурс, Т. И. Осипова, Л. А. Щербакова, Н. С. Жемчужина, О. Д. Микитюк, Т. А. Назарова
Поступило 22.07.2010 г.
Микотоксины, широко распространенные в природе метаболиты плесневых микроскопических грибов, являются наиболее опасными загрязнителями сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов. Они обладают высокой токсичностью, вызывая тяжелые отравления у людей и животных, а некоторые из них являются канцерогенами. Устойчивость микотоксинов обусловливает необходимость жесткого контроля их содержания в сельскохозяйственной и пищевой продукции (предельно допустимые концентрации порядка 0.1—20 мг/кг для разных токсинов). Экономический ущерб, причиняемый микоток-синами, оценивается во многие миллиарды долларов ежегодно.
Известны разнообразные природные и синтетические вещества (сапонины из женьшеня, цитрусовое масло, сульфамиды, органические кислоты, меркаптоэтанол и т.п.), которые могут повышать или снижать образование микотоксинов, однако причины их активности остаются неясными [1]. Показано, что фунгицидная активность ряда природных фенольных соединений может сочетаться со способностью тормозить токсино-генез [2]. Известный способ детоксикации кормов и продуктов обработкой аммиаком при повышенном давлении и температуре имеет очевидные ограничения [3].
Таким образом, проблема избирательного воздействия на образование микотоксинов остается актуальной, и одним из перспективных направлений ее решения представляется создание низкомолекулярных специфических регуляторов биосинтеза микотоксинов, чему и посвящено настоящее исследование.
Институт молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардта
Российской Академии наук, Москва
Всероссийский научно-исследовательский институт
фитопатологии
Российской академии сельско-хозяйственных наук, Голицыно Московской обл.
Среди микотоксинов особое внимание уделяется фузариотоксинам и афлатоксинам, которые продуцируются грибами родов Fusarium и Aspergillus соответственно, представляют наибольшую опасность для человека и животных и являются экономически значимыми.
Терпеноидный путь биосинтеза характерен для фузариотоксинов, например, токсина Т-2 и дез-оксиниваленола, основными предшественниками которых являются мевалоновая кислота и фарнезилпирофосфат. В настоящее время не известны соединения, способные подавлять биосинтез токсинов этой группы.
Большая группа микотоксинов, включая афлатоксин В1 (рис. 1) и зеараленон, относится к поликетидам, важному и многочисленному классу природных соединений, начальным этапом биосинтеза которых является конденсация аце-тил-СоА с несколькими молекулами малонил-СоА с последующими многостадийными превращениями промежуточных ß-поликетонов [4].
Известны два вида химических соединений, которые способны подавлять биосинтез полике-тидов и причины активности которых выяснены. Фунгицид трициклазол (5-метил-1,2,4-триазо-ло[3.4-Ь]бензотиазол) ингибировал поздние специфические этапы поликетидного пути образования меланина, пигмента клеточной стенки гриба Magnaporthe grisea (Hebert) Barr, возбудителя пи-рикуляриоза риса, но не был способен тормозить синтез других поликетидов [5, 6].
Представителем другого вида веществ являлась 1-аминоэтилфосфиновая кислота (1, в табл. 2), которая тормозила образование токсина пирику-лола (рис. 1), продуцируемого грибом M. grisea, что было первым примером направленного химического воздействия на биосинтез микотоксинов [6]. При испытаниях на агаризованной полной среде выращивания кислота 1 в концентрации 0.001% не была фунгитоксична, но подавляла синтез пирикулола в результате ингибирования образования ацетил-CoA (схема 1, где R = СН3 (1)) [6, 7]. Как аналог аланина, кислота 1 транспортировалась в клетку патогена аминокислот-
ной пермеазои, превращалась внутриклеточно в аналог пирувата, 1-оксоэтилфосфинат, который ингибировал пируватдегидрогеназу, что блокиро-
вало образование ацетил-СоА, исходного соединения как в синтезе пирикулола, так и других по-ликетидов.
Схема 1
Аминоалкил ^ Транспорт ^ Ферментативные ^ Аналог ^ фосфинаты в клетку превращения пирувата
RCH(NH2)PO2N2 СН3-С(0)-Р02Н2
^ Ингибирование пируватдегидрогеназы
Было показано, что аналогичной активностью обладали фосфиновые аналоги аспартата и ß-заме-щенного аланина (схема 1, R = СН2С02Н, СН20Н, CH20S03H, СН^Н и т.п.), способные фермента-тивно превращаться в аналог пирувата, что повышало потенциал активности этой группы веществ, поскольку позволяло использовать разные пути метаболизма для генерации ингибитора [7].
Селективность действия фосфиновых аналогов аминокислот показана нами в экспериментах по влиянию этих соединений на образование тер-пеноидных токсинов грибом Fusarium sporotri-chiella и поликетидных токсинов грибами Fusarium graminearum и Aspergillus flavus (табл. 1). В этих опытах штаммы-продуценты токсинов выращивали на агаризованной среде Чапека или на автоклавированном зерне риса. В первом варианте оценивали влияние препаратов на рост мицелия грибов, во втором — определяли содержание токсинов в обработанном испытуемыми веществами зерне, используя известные методы. Результаты синтеза фосфиновых аналогов были опубликованы ранее [7].
На искусственной питательной среде все соединения в концентрации 0.1% эффективно тормозили рост мицелия испытанных штаммов грибов. Значительные различия отмечались во влиянии препаратов этой же концентрации на содержание токсинов в зараженном зерне риса (табл. 1). Фосфиновые аналоги аланина (R = СН3), аспартата (R = Н0С0СН2) и лейцина (R = (СН3)2СНСН2) действительно тормозили образование полике-
O
O
HO
Пирикулол
O' ^ "OCH3 Афлатоксин B1
Блокирование синтеза ацетил-СоА, меланина и пирикулола
Рис. 1. Формулы микотоксинов — пирикулола и афлатоксина.
тидных микотоксинов. Эти же соединения слабо влияли на биосинтез терпеноидного токсина Т-2, а в случае дезоксиниваленола они стимулировали образование токсина, что ранее не отмечалось при изучении фунгицидной активности аминоал-килфосфинатов и что могло быть свойственно и другим соединениям этого вида.
В этой связи нами было изучено влияние фос-фоаналогов аминокислот разного строения на продукцию афлатоксина В1 с использованием токсинообразующего изолята А11 гриба A. flavus, который выращивали на жидкой среде Пэйна — Хэглера с заменой гидролизата казеина на про-лин, чтобы исключить конкуренцию испытуемых соединений с аминокислотами среды. Содержание афлатоксина определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией, активность фосфоаналогов оценивали по минимальным концентрациям, которые вызывали статистически достоверное увеличение или снижение содержания афлатоксина в фильтратах культуральной жидкости по сравнению с контролем. Влияние веществ на рост продуцента афлотоксина оценивали по накоплению биомассы при выращивании гриба в погруженной культуре или по интенсивности роста мицелия на агаризованной среде Пейна—Хэглера.
Как явствует из данных табл. 2, соединения 1 и 2, мощные ингибиторы образования поликетида меланина [6], оказались стимуляторами биосинтеза поликетида афлатоксина. Рацемат соединения 1 в концентрации 0.1% подавлял рост мицелия и синтез токсина, однако при концентрации 0.001% количество токсина увеличивалось в 5 раз без влияния на рост мицелия. Не было отмечено существенных отличий в действии (Д)-изомера аналога 1, что при данной схеме испытаний позволяло не учитывать фактор хиральности препаратов. Значение группировки P(O)(OH)H в стимулирующем действии фосфиновых аналогов подтверждалось высокой активностью соединения 3, которое не было способно ингибировать синтез поликетидов. Эффекты, вызываемые этой группировкой, можно было бы определить как "фосфиновый стресс", подобно известной акти-
ХИМИЧЕСКОЕ РЕГУЛИРОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА
561
Таблица 1. Влияние фосфиновых аналогов ЯСН(МН2)Р(0)(0Н)Н на токсигенез грибов Б 8рого1псЫе11а, Б. §гаштеагиш и А. Аауш в условиях культивирования на автоклавированном зерне риса
Соединение, Я* Терпеноидные микотоксины** Поликетидные микотоксины**
токсин Т-2 дезоксиниваленол зеараленон афлатоксин В1
СН3 152 198 23 48
Н0С(0)СН2 77 490 36 88
(СН3)2СНСН2 90 545 92 60
* Концентрация соединений 0.1%. ** Содержание токсинов в зерне по сравнению с контролем, %.
Таблица 2. Влияние фосфоаналогов аминокислот на продукцию афлатоксина В1 гриба А. йауш в условиях глубинного культивирования на среде Пейна—Хэглера
№ соединения Соединение Концентрация соединений, % Афлатоксин В1*, %
1 (К,Р>- и (Я)-СН3СН(МН2)Р(0)(0Н)Ы 0.001 516
2 (СН3)2С(МН2)Р(0)(0Н)И 0.01 307
3 Н0С(О)СН2СН(МН2)Р(0)(0Н)И 0.1 392
4 СН3СН(МН2)Р(0)(0Н)0Ы 0.01 100
5 СН3СН(МН2)Р(0)(0Н)0СЫ3 0.01 62
6 СН3СН(МН2)Р(0)(0Н)0С2Ы5 0.001 65
7 СН3СН(МН2)Р(8)(0Н)2 0.001 36
8 МН2СН2Р(8)(0Н)2 0.01 18
* Содержание токсина В1 в культуральной жидкости по сравнению с контролем.
вации биосинтеза токсинов в результате окислительного стресса [8]. В таком случае стимулирующие эффекты фосфиновых аналогов могли бы сниматься фенольными соединениями аналогично тому, как описано в работе [2].
Ингибиторы образования афлатоксина были найдены нами среди аналогов аминокислот, модифицированных по фосфорсодержащей функции. На примере соединения 1 было показано, что введение различных заместителей вместо водорода фосфинового фрагмента позволяет регулировать стимулирующую и ингибирующую активность аналогов (табл. 2). Так, фосфонатный аналог 4 практически не влиял на биосинтез токсина, тогда как результатом замены водорода на метоксильную или этоксильную группы явились активные ингибиторы токсиногенеза 5 и 6, которые не влияли на рост мицелия и действие которых было обусловлено, очевидно, торможением поликетидного пути биосинтеза токсина.
Ингибиторы токсиногенеза с иным механизмом действия были получены нами на основе 1-амино-алкилтиофосфоновых кислот, нового вида биологически активных и мало токсичных аналогов аминокислот [9, 10]. В эк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.