ГЕНЕТИКА, 2008, том 44, № 8, с. 1013-1022
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 577.21
ХИТИНАЗЫ В БИОИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
© 2008 г. А. В. Шахбазов, Н. А. Картель
Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси, Минск 220072;
e-mail: a.shakhbazau@igc.bas-net.by Поступила в редакцию 25.01.2007 г.
Технологии интродукции чужеродных генов в геном растений активно развиваются как средство качественного направленного улучшения свойств сельскохозяйственных культур. Одним из важнейших направлений работ в биоинженерии растений является поиск и изучение перспективных генов, в частности с целью создания генотипов с повышенной устойчивостью к патогенам и вредителям. В обзоре рассматривается применение в данном качестве трансгенов, кодирующих ферменты семейства хитиназ, многие из которых зарекомендовали себя как эффективные факторы повышения устойчивости растений к патогенным грибам.
С развитием сельского хозяйства все более актуальной становится проблема борьбы с патогенами и вредителями, которые поражают сельскохозяйственные культуры и тем самым приводят к существенным потерям урожая и снижению качества продукции. Для снижения ущерба были разработаны стратегии, основанные на генетических, химических и биологических подходах, дополняемых улучшением методов культивирования и севооборота. В частности, одним из перспективных путей защиты растений от заболеваний является создание и использование устойчивых к патогенам форм растений. Программы селекции привели к появлению ряда резистентных сортов, однако результаты долгого труда селекционеров зачастую сводятся на нет быстрой эволюцией фитопатогенов и появлением форм, способных к преодолению устойчивости растения. Селекционеры зачастую сталкиваются с проблемой переноса нежелательных признаков вместе с ценными генами устойчивости, а в последнее время - и с истощением потенциальных источников генов [1].
Развитие генноинженерных технологий и раскрытие молекулярной природы защитных механизмов растений обеспечили возможность разработки принципиально новых стратегий борьбы с заболеваниями растений в дополнение к существующим традиционным подходам, основанным на применении химикатов либо на классических методах селекции. Большинство альтернативных биотехнологических стратегий основано на конститутивной гиперпродукции какого-либо элемента (элементов) защитной системы растения; некоторые подходы используют гиперчувствительный ответ (ИИ) - быструю, локализованную вокруг точки инфекции гибель пораженных тканей, что обусловливает устойчивость всего растения к поражению.
В целом биотехнологические стратегии по созданию устойчивых к патогенам трансгенных растений основываются на двух базовых подходах: I) конститутивной продукции в растении одного или нескольких антимикробных соединений (протеинов или токсинов) и II) формировании гиперчувствительного ответа посредством использования ^-генов или системной приобретенной резистентности. В первом подходе, в свою очередь, могут быть выделены: 1) экспрессия генов, продукты которых непосредственно токсичны для фитопатогенов либо способны угнетать их рост, в частности РИ-протеины и фитоалексины; 2) экспрессия генов, продукты которых деградируют или нейтрализуют какой-либо важный компонент патогена, например полигалактуроназы, оксаловая кислота и липазы; 3) экспрессия генов, продукты которых повышают структурную защиту растений (пероксидазы, лигнин); 4) экспрессия генов, обеспечивающих продукцию сигналов регуляции защитных систем растения (пероксид водорода Н202, салициловая кислота, этилен и специфичные сигнальные молекулы).
Инфекции различных патогенных грибов наносят значимый ущерб растениям; для культивируемых сортов вследствие их невысокого генетического разнообразия эта проблема особенно актуальна. Несмотря на отсутствие иммунной системы у растений, в ходе эволюции им удалось выработать множество защитных механизмов, в том числе синтез низкомолекулярных соединений, протеинов и пептидов, обладающих антигрибной активностью [2-4]. Также противогриб-ные соединения синтезируются бактериями, насекомыми, моллюсками, млекопитающими и самими грибами для вытеснения конкурирующих видов [5, 6]. Противогрибные протеины задействованы в комплексе конститутивной либо индуцируемой резистентности, что позволяет расте-
Р(1,3)-глюкан
Клеточная стенка гриба (адаптировано из [9]).
ниям и животным достаточно эффективно противодействовать грибной инфекции. Совокупность подобных пептидов и белков принято называть PR(pat:hogenesis-related)-протеинами. Одними из наиболее активно используемых в генноинженер-ных работах PR-протеинов являются хитиназы благодаря хорошо изученному механизму действия и широкому кругу грибов, рост которых может быть ингибирован посредством биоинженерного применения хитиназ.
РОЛЬ ХИТИНАЗ КАК АНТИГРИБНЫХ АГЕНТОВ
Одной из основных мишеней антигрибных агентов является клеточная стенка грибных патогенов. Она защищает гриб от неблагоприятных условий внешней среды и обеспечивает передачу сигналов для инвазии и заражения растения-хозяина. Клеточная стенка представляет собой сложную структуру, состоящую из хитина, различных глюканов, липидов и пептидов, встроенных в белковом матриксе (рисунок). Вследствие наличия у грибов существенного внутреннего тургорного давления даже незначительное нарушение целостности клеточной стенки может вызвать лизис клетки гриба [7, 8].
Некоторые классы антигрибных протеинов ингибируют синтез клеточной стенки грибов, вызывают нарушение ее структуры и/или функции, другие атакуют клеточную мембрану гриба, что также ведет к лизису клетки. Среди прочих механизмов можно упомянуть формирование мем-
бранных каналов и пор, повреждение рибосом, ингибирование синтеза ДНК и клеточного цикла. Большинство антигрибных протеинов являются мощными ингибирующими агентами с МИК (минимальной ингибирующей концентрацией) в пределах 50 мкг на 1 мл, что соответствует уровню используемых в сельском хозяйстве традиционных фунгицидов [9].
Антигрибные агенты в большом разнообразии представлены в самых различных организмах. Вместе с тем только для PR-протеинов II класса (глюканазы) и III класса (хитиназы) детально изучен механизм их антигрибного действия.
Хитиназы были выделены из грибов [10, 11], растений [12-14], животных [15, 16], бактерий [17, 18], вирусов и др. [19] и обладают существенным ингибирующим эффектом в отношении широкого спектра растительных и животных патогенов, в частности родов Trichoderma, Alternaría, Fusarium, Rhizoctonia, Guignardia, Botrytis, Coprinus и др. [9, 20, 21]. Механизм их антигрибного действия, в противоположность некоторым другим агентам, - достаточно "прямолинеен": хитиназы расщепляют хитин - неветвящийся гомополимер Р-1,4-связан-ных сахаров N-ацетилглюкозаминов (2-ацетами-до-2-дезокси-Б-гликопиранозидов, GlcNAc), являющийся одним из основных структурных компонентов клеточной стенки грибных патогенов [9] и некоторых водорослей [22]. Хитин (рисунок) составляет от 22 до 44% клеточной стенки грибов [23]. Он является вторым по распространенности полимером в природе после целлюлозы. Во многих организмах хитин модифицируется посредством формирования связей с другими полимерами - глюканами, протеинами и др. Деградация хитиновых полимеров клеточной стенки in situ ослабляет клеточную стенку, приводит к нарушению ее структуры и вызывает осмотический стресс, приводящий к гибели грибного возбудителя. Также хитин содержится в периотрофном матриксе насекомых - внеклеточной структуре, обеспечивающей механическую защиту эпителиальных клеток и компартментализацию пищеварительных ферментов насекомых [22]. Это обусловливает его роль как мишени для хитиназ в инсектицидных целях; показан протективный эффект трансгенов хитиназы против тли Aula-corthum solani, Lacanobia oleracea [21], Oryzaephilis mercator и др. [24].
Хитин также присутствует в организме моллюсков и ракообразных; в растениях, позвоночных и прокариотах хитина не содержится. Хитиназы тем не менее были выделены из весьма широкого круга организмов. В зависимости от организма различается роль хитиназ. У бактерий они задействованы в процессах питания и паразитизма; в грибах, простейших и беспозвоночных
они также участвуют в морфогенезе; растения и позвоночные используют хитиназы для защиты от патогенов, а бакуловирусы - в процессах патогенеза [19, 25]. В масштабе экосистем хитиназы играют важную роль как факторы деградации хитина и формирования таким образом источников углерода и азота для живых организмов. Бактерии и грибы выработали сложные многостадийные системы деполимеризации, транспорта и метаболизма хитина и хитоолигосахаридов [26].
КЛАССИФИКАЦИЯ ХИТИНАЗ
Хитиназы подразделяются на две основные категории - эндо- и экзохитиназы [27]. Эндохити-назы (ЕС 3.2.1.14) расщепляют хитин в произвольных внутренних сайтах с образованием низкомолекулярных мультимеров К-ацетилглюко-замина, таких как хитотриоза, хитотетраоза и димер диацетилхитобиоза. Экзохитиназы подразделяются на две субкатегории: хитобиозидазы (ЕС 3.2.1.29), катализирующие высвобождение диацетилхитобиоз с невосстанавливающего конца хитиновой микрофибриллы, и Р-1,4-К-ацетилглю-козаминидазы (ЕС 3.2.1.30), расщепляющие оли-гомерные продукты эндохитиназ и хитобиозидаз с образованием мономера в1еКАе.
Хитиназы из различных организмов принято также подразделять на пять основных классов [27] по принципу их аминокислотного состава и структурных различий. Помимо аминокислотной гомологии, которая в случае равномерной дис-пергированности по последовательности гена соответствует гомологии фолдинга протеина, характеристиками, определяющими принадлежность хитиназ к тому или иному классу, являются: К-терминальный домен, локализация фермента, изоэлектрический рН, сигнальные пептиды и индукторы [28]. В частности, хитиназы I класса содержат К-терминальный цистеин-богатый домен размером около 40 аминокислот, хитин-связыва-ющий хевеиноподобный домен, высококонсервативный центральный регион и петлю; имеют ва-лин-богатый сигнальный пептид и локализованы вакуолярно. Класс I далее подразделяется на су
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.