ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 517-519
УДК 577.151.54:577.152.3:57.083.132
ХИТИНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
© 2004 г. А. А. Шубаков, П. С. Кучерявых
Институт физиологии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар, 167982; e-mail: shubakov@physiol.komisc.ru Поступила в редакцию 18.11.2003 г.
Исследована хитинолитическая активность 9 видов мицелиальных грибов, принадлежащих к 7 родам: Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Paecilomyces, Sporotrichum, Beauveria и Mucor. Показано, что все они при культивировании в жидкой среде с кристаллическим хитином (1%) образуют внеклеточные хитиназы с активностью от 0.2 ед./мг белка (Sporotrichum olivaceum, Mucor sp.) до 4.04.2 ед./мг белка (Trichoderma lignorum, Aspergillus niger).
Хитин, второй после целлюлозы возобновляемый продукт биосферы, является линейным гли-козаминогликаном, образованным остатками К-ацетил^-Б-глюкозамина, связанными между собой ß-1,4-связями [1, 2]. Хитин высоко устойчив к химическим реагентам и в виде комплексов с белком составляет основной компонент наружного скелета ракообразных, насекомых, входит в состав клеточной стенки грибов [1-3].
Хитин гидролизуется двумя типами ферментов, которые обычно действуют в синергизме: хи-тиназа и ß-N-ацетилгексозаминидаза [4, 5]. Хити-наза (эндо-хитиназа, хитинглюканогидролаза, КФ 3.2.1.14) расщепляет гликозидные связи хитина случайным образом, в конечном итоге образуя короткие олигомеры К-ацетил^-Б-глюкозамина, в основном димер хитобиозу и в меньшей степени -хитотриозу. Фермент ß-N-ацетилгексозаминидаза (хитобиаза, КФ 3.2.1.52) действует одной из последних, гидролизуя хитобиозу и хитотриозу [3, 6-8].
Хитиназы в природе выполняют ряд функций, включая морфогенетическую, защитную, питательную и патогенную [4, 7, 9]. Хитиназы встречаются как у эукариотных, так и у прокариотных организмов. Хитиназы обнаружены у высших растений, некоторых беспозвоночных, членистоногих, нематод; биосинтез хитиназ широко распространен у бактерий и грибов. В настоящее время основными биотехнологическими источниками хитиназ являются микроорганизмы. Среди бактерий-продуцентов хитиназ наиболее широко представлены виды Streptomyces, Vibrio, Serratia, Bacillus [10-13]. Бактериальные штаммы Serratia marcescens и Streptomyces griseus используются для коммерческого получения хитинолитических ферментов [4, 11].
Грибные продуценты хитиназ, по сравнению с бактериальными, исследованы в меньшей степени. Единственный промышленный хитиназный препарат грибного происхождения получают из
селектированных штаммов Trichoderma har-zianum. В лабораторном масштабе для получения хитиназ использованы иммобилизованные клетки Penicillium janthinellum [4]. Исследовано образование хитиназ у грибов Talaromyces emersonii, Neurospora crassa, Beauveria bassiana, Choanephora cucurbitarum, Phascolomyces articulosus [3, 14-16].
Цель работы - проверка некоторых мицелиальных грибов на хитинолитическую активность.
МЕТОДИКА
В работе использовали культуры мицелиальных грибов, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ): Aspergillus niger F-1119, A. terreus F-1025, Penicillium funiculosum F-1115, Paecilomyces variotii F-378 и из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ): Trichoderma viride 13/10. Объектами исследования являлись также энтомопатогенные грибы, выделенные сотрудниками Сыктывкарского госуниверситета из насекомых (Beauveria bassiana, Sporotrichum olivaceum) и из дерново-подзолистых почв (Trichoderma lignorum, Mucor sp.) Республики Коми.
В качестве посевного материала использовали 2-суточные культуры грибов, выращенных в среде с 1% глюкозы. Среда имела следующий состав (г/л): дрожжевой экстракт - 1.0, (NH4)2SO4 - 5.0, KH2PO4 - 10.0, MgSO4 ■ 7H2O - 1.0.
Культуры выращивали в колбах Эрленмейера при перемешивании (220 об/мин) с объемом питательной среды 50 мл при исходном значении рН 5.0 и 24°C. Ферментационные колбы со средой того же состава засевали посевным материалом из расчета 5 мл инокулята на 50 мл среды. Источниками углерода служили (%): глюкоза - 1.0, хитин кристаллический из панциря крабов - 1.0.
Активность внеклеточной хитиназы в супер-натантах определяли после центрифугирования
518
ШУБАКОВ, КУЧЕРЯВЫХ
Хитиназная активность грибов при культивировании в средах с кристаллическим хитином и глюкозой
Культура Активность хитиназы, ед./мг белка
хитин (1%) хитин (1%) + глюкоза (1%)
Aspergillus niger 4.2 ± 0.2 -
A. terreus 1.9 ± 0.1 -
Penicillium funiculosum 2.2 ± 0.2 -
Trichoderma viride 2.5 ± 0.2 -
T. lignorum 4.0 ± 0.2 -
Paecilomyces variotii 2.3 ± 0.1 -
Mucor sp. 0.2 ± 0.1 -
Sporotrichum olivaceum 0.2 ± 0.1 2.1 ± 0.2
Beauveria bassiana 2.4 ± 0.2 3.8 ± 0.2
Serratia marcescens [9] 1.5-11.0 -
"-" - определение не проводили.
грибных культур (5000 g, 20 мин) с 1% суспензии коллоидного хитина в 0.05 М ацетатном буфере (рН 5.0). Редуцирующие сахара определяли по методу Сомоджи-Нельсона [17, 18]. За единицу активности хитиназы принимали такое количество фермента, которое освобождало при данных условиях из коллоидного хитина 1 мг N-ацетил-Б-глюкозамина за 1 ч инкубации. Содержание белка определяли по Лоури. Коллоидный хитин был получен из кристаллического по методу [10].
В таблице представлены средние арифметические величины и их стандартные ошибки, полученные из трех независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Бактериальные и грибные хитиназы, как считают, являются индуцибельными ферментами и синтезируются в средах, содержащих хитин [6, 7, 9, 11, 14]. Хитиназа у Streptomyces, Beauveria, Coprinus может синтезироваться на субстратах, отличающихся от хитина [3]. Кроме того, мито-мицин С и налидиксовая кислота - индукторы SOS-функций клетки, индуцируют биосинтез хитиназы у бактерий на средах, не содержащих хитина, и повышают ее биосинтез на средах с хитином [9, 12, 19]. У некоторых штаммов Serratia marcescens хитиназа синтезируется конститутивно [19]. Глюкоза оказывает на хитинолитический комплекс ингибирующее действие [3].
Традиционным источником хитиназ являются бактериальные штаммы Serratia marcescens, которые продуцируют внеклеточные хитиназы с активностью 1.5-11.0 ед./мг белка [9]. Некоторые из тестируемых нами штаммов мицелиальных
грибов также обнаруживают сравнимые уровни внеклеточной хитинолитической активности.
Проверка 9 видов мицелиальных грибов, принадлежащих к 7 родам (Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Paecilomyces, Sporotrichum, Beauveria, Mucor), на хитинолитическую активность показала (таблица), что все они при культивировании в течение 5 сут в жидкой питательной среде с кристаллическим хитином (1%) способны утилизировать субстрат. Активность внеклеточной хитиназы у тестируемых грибов варьирует. Наибольший уровень активности обнаруживался у видов T. li-gnorum и A. niger - 4.0 и 4.2 ед./мг белка соответственно. В 1.6-2.2 раза активность внеклеточной хитиназы была ниже у грибов T. viride, B. bassi-ana, P. variotii, P. funiculosum, A. terreus и составляла 1.9-2.5 ед./мг белка. Незначительная хитино-литическая активность (0.2 ед./мг белка) обнаруживалась в культурах Mucor sp. и S. olivaceum.
Хитинолитическая активность не выявлялась при культивировании грибов в среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу (1%). Очевидно, тестируемые грибы продуцируют ин-дуцибельные хитиназы.
Повышения выхода ферментов, в том числе и хитиназ, можно добиться при использовании двухкомпонентных источников углерода, содержащих легкометаболизируемый субстрат как источник роста и индуктор синтеза ферментов. Два аборигенных энтомопатогенных гриба - S. olivaceum и B. bassiana, - были испытаны на способность образовывать хитиназы при культивировании в среде с кристаллическим хитином (1%) и глюкозой (1%) (таблица). Хитиназная активность составляла от 2.1 до 3.8 ед/мг белка соответственно, что в 1.6-10.5 раз выше, чем в среде только с хитином (1%).
Активность хитиназы энтомопатогенного гриба B. bassiana в процессе роста культуры увеличивалась от 1.9 (через 3 сут) до 2.8 ед/мг белка (через 10 сут), и далее существенно не повышалась. Считается, что внеклеточная хитиназная активность возрастает пропорционально росту биомассы и достигает максимума в стационарной фазе роста [11].
Таким образом, проведенная проверка 9 видов мицелиальных грибов, принадлежащих к 7 родам, позволяет заключить, что способность образовывать внеклеточные хитиназы довольно широко распространена среди этой группы микроорганизмов. Все они могут в той или иной степени утилизировать хитин в качестве единственного источника углерода и энергии в среде и синтезировать при этом хитиназы.
ХИТИНОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
519
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Феофилова Е.П, Терешина В.М., Меморская А.С. // Микробиология. 1995. Т. 64. № 1. С. 27-31.
2. Феофилова Е.П., Немцев Д.В., Терешина В.М., Козлов В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 5. С. 483-492.
3. Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А., Рылкин С.С. // Прикл. биохимия и микробиология. 1976. Т. 12. № 4. С. 581-586.
4. Fenice M, Di Giambattista R., Raetz E, Leuba J -L, Fe-derici F. // J. Biotechnol. 1998. V. 62. № 1. P. 119-131.
5. Watanabe T, Kono M, Aida K, Nagasawa H. // Bio-chim. Biophys. Acta. 1998. V. 1382. № 1. P. 181-185.
6. Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А. // Прикл. биохимия и микробиология. 1976. Т. 12. № 2. С. 238-242.
7. Sampson M.N., Gooday G.W. // Microbiology. 1998. V. 144. № 10. P. 2189-2194.
8. BrurbergMB, Nes I F., Eijsink V.G.H. // Microbiology. 1996. V. 142. № 5. P. 1581-1589.
9. Порфиръева О.В., Юсупова Д.В., Зоткина Н.Л., Соколова Р.Б., Габдрахманова Л.А. // Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 347-353.
10. Трачук Л.А., Шемякина Т.М., Честухина ГГ., Степанов В.М. // Биохимия. 1996. Т. 61. № 2. С. 357-368.
11. Бабенко А.Ю., Дмитриева Е.Ю., Шелегедин В Н. // Биотехнология. 1998. № 3. С. 13-18.
12. Юсупова Д.В., Порфиръева О.В., Соколова Р.Б., Пономарева А.З., Габдрахманова Л.А. // Биотехнология. 1997. № 2. С. 3-9.
13. Okazaki K, Kato F., Watanabe N., Yasuda S., Masui Y, Hayakawa S. // Biosci. Biotech. Biochem. 1995.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.