ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 421, № 2, с. 199-201
== ХИМИЯ
УДК 577.1:544.77
ХИТОЗАН - ПРИРОДНЫЙ ПОЛИМЕР ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ НАНОЧАСТИЦ
© 2008 г. Ä. В. Ильина, В. П. Варламов, Ю. Ä. Ермаков, В. Н. Орлов, К. Г. Скрябин
Представлено академиком A.A. Берлиным 09.02.2008 г. Поступило 14.02.2008 г.
Частицы с линейным размером 1-100 нм проявляют необычайные и часто трудно предсказуемые свойства. Они обладают высокой активностью, с ними возможно осуществлять реакции, которые не происходят с частицами макроскопического размера. Биологическая активность наночастиц зачастую в десятки раз выше активности, проявляемой более крупными частицами. Существует большое разнообразие как синтетических, так и природных полимерных систем для создания наночастиц. Разработка и изучение их является одним из направлений интенсивно развивающихся нано-технологий [1].
Хитин - природный полисахарид, имеющий химическое строение поли-1^4, Р-Ь(К-ацетил-2-ами-но-2-дезоксиглюкопираноза), хитозан - его дезаце-тилированное производное. Хитозан активно применяют в медицинской, косметической, пищевой и других отраслях промышленности [2-7]. Он обладает биосовместимостью с живыми тканями, т.е. не вызывает аллергических реакций и отторжения организмом. Разлагается под действием ферментов клетки, характеризуется малой токсичностью, легко выводится из организма, не вызывая побочных реакций [8].
Хитозан - аминополисахарид, который при нейтральных и щелочных значениях рН содержит свободные аминогруппы (-КН2), в кислых условиях
они протонированы (-КН+), что открывает возможности ионного сшивания при взаимодействии с полианионами [9].
Центр "Биоинженерия" Российской Академии наук, Москва Институт физической химии и электрохимии им. А Н. Фрумкина Российской Академии наук, Москва Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва
Цель исследования - установление взаимосвязи основных физико-химических характеристик (молекулярная масса, степень дезацетилирова-ния), а также индекса полидисперсности образцов гидролизатов хитозана с возможностью формирования наночастиц, их размером и значением поверхностного заряда.
Образцы хитозана, используемые для формирования наночастиц, с молекулярной массой (М.м.) 340000-30000 (индекс полидисперсности гидролизатов 1.4-1.6) получали гидролизом в молочной кислоте [10] из хитозана (крабового) М.м. 700000 и степенью дезацетилирования (СД) 0.85 ± ± 0.03. Образец хитозана М.м. 12000 (индекс полидисперсности гидролизата 3.8), СД 0.85 ± 0.03 был получен ферментативной деполимеризацией препаратом "Целловиридин", содержащим набор карбогидролаз неспецифического действия по отношению к хитозану [11]. Следует отметить, при гидролизе СД не менялась, ее определение проводили методом кондуктометрического титрования [12]. Средневязкостную М.м. образцов рассчитывали, используя уравнение Марка-Хаувинка и коэффициенты, приведенные в работе [13]. Образцы хитозана с СД 0.82, 0.60 и 0.43 получали реацети-лированием хитозана (СД 0.89) согласно методике [14].
Хитозан имеет кажущуюся константу диссоциации сопряженной кислоты рКа 6.5-6.7 и является поликатионом. Для получения наночастиц использовали 0.1-0.3%-ные растворы хитозана в уксусной кислоте, концентрация которой каждый раз была в 1.5 раза больше, чем концентрация раствора хитозана. В качестве противоположно заряженной макромолекулы использовали 0.04-0.12%-ный раствор Ка-соли триполифосфата (ТПФ), который при кислых значениях (рН 3)
присутствует в виде фосфониевого иона (Р3 О5-). Благодаря комплексообразованию между противоположно заряженными ионами макромолекул (рис. 1) хитозан подвергается ионному гелеобра-зованию и возникает суспензия частиц [15].
200
ИЛЬИНА и др.
CH2OH
H
-а н
H
+
NH3
\
H
OH H
I/
а
OH H
H
O
H
nH 3
H
O-
CH2OH
OH
HO-P=O
ъ
HO-P=O \
о
HO-P=O \
+ O-
H
NH3
CH2OH
H
H
N
N
OH H H
-O H
CH2OH
ON
H
OH
OH
H
O
H
+
NH3
Рис. 1. Схема взаимодействия хитозана с триполифос-фатом при ионотропном гелеобразовании.
При взаимодействии хитозана с ТПФ в зависимости от концентрации наблюдали сохранение без видимых изменений раствора либо образование осадка, либо опалесцирующей суспензии. Последняя на 91-76% состояла из частиц размером 100-200 нм. Для их характеристики использовали значение дзета-потенциала, отражающее электрический потенциал на поверхности частиц, измеренный методом динамического квазиупругого светорассеяния суспензии хитозана в 0.01 М растворе KCl при 22°C (табл. 1). Гидродинамический диаметр определяли методом динамического светорассеяния. Измерения проводили в 0.01 М фосфатном буфере (рН 7.5) при длине волны 532 нм и 25°С. Поверхностный заряд наночастиц является критическим параметром стабильности суспензии; благодаря одноименному заряду на поверхности частицы отталкиваются друг от друга,
что препятствует агрегации. Их образование оказалось возможным при средних концентрациях комплексообразующих растворов и соотношении объемов хитозан-ТПФ как 2 : 1 и 2.5 : 1. Из результатов, представленных в табл. 1, следовало, что увеличение концентрации растворов при формировании частиц приводит к снижению поверхностного заряда наночастиц.
С целью поддержания гидрофильно-гидрофобного баланса в процессе образования частиц и их дополнительной стабилизации использовали поверхностно-активное вещество ПЭГ-2000. Влияние его концентрации (10-50 мг/мл) на значение поверхностного заряда частиц в процессе их формирования было незначительным (значения дзета-потенциала составляли 38-42 мВ). Размер частиц в суспензии с увеличением концентрации по-лиэтиленгликоля (ПЭГ) уменьшался с 240 (87%) до 106 (91%) нм.
Основные характеристики молекулы хитозана -СД и М.м., отражающие взаимосвязь структура-функция, оказывали влияние на значение заряда и размер частиц. Чем выше СД (М.м. постоянная), тем больше в молекуле полимера протони-рованных аминогрупп, доступных для комплексо-образования, тем больше значения заряда на поверхности частиц (табл. 2). Низкое значение дзета-потенциала при СД 0.43 можно объяснить как недостаточным количеством протонирован-ных аминогрупп для формирования частиц, так и небольшой их доступностью из-за более плотной упаковки молекул полимера в растворе (по структуре биополимер уже ближе к молекуле хитина, чем хитозана). Размер частиц для образцов хитозана с М.м. 42000 и переменной СД составлял 300-400 нм.
Как показали проведенные исследования, увеличение размеров частиц вызвано агрегацией их во времени, подтверждением служило также снижение дзета-потенциала на 30-50%. Процесс имел обратимый характер. Обработка суспензии наночастиц ультразвуком приводила к восстановлению значения поверхностного заряда и уменьше-
Таблица 1. Влияние концентрации растворов хитозана и Ка-соли триполифосфата на процесс формирования наночастиц
ТПФ, мг/мл Значение дзета-потенциала (мВ) при концентрации хитозана, мг/мл
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
1.0 Осадок 32 38 51 26
1.2 « 30 34 46 21
Примечание. М.м. хитозана 340000 при СД 0.85; концентрация ПЭГ-2000 - 30 мг/мл; при концентрации ТПФ 0.4-0.8 и хитозана 1.0-3.0 мг/мл наночастицы не образуются.
Таблица 2. Влияние СД и М.м. хитозана на дзета-потенциал в процессе формирования наночастиц
СД при М.м. 42000 Дзета-потенциал, мВ М.м. при СД 0.85 Дзета-потенциал, мВ
0.89 34 126000 30
0.82 33 60000 19
0.60 25 30000 13
0.43 8 12000 13
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 421 < 2 2008
ХИТОЗАН - ПРИРОДНЫЙ ПОЛИМЕР
201
нию размера частиц. Дзета-потенциал наночастиц уменьшался более чем в два раза при снижении М.м. с 126000 до 12000 и постоянном значении СД (табл. 2). Размер частиц, полученных из образцов хитозана М.м. 12000, 30000 и 60000, составлял 10-15 нм, а для хитозана М.м. 126000 - 500 нм.
Увеличение размера частиц больше чем на порядок, возможно, объяснялось более высокой склонностью к гелеобразованию и более низкой растворимостью высокомолекулярного хитозана в 2%-ной уксусной кислоте по сравнению с низкомолекулярными образцами и, как следствие, большей склонностью к агрегированию. При помощи атомно-силовой микроскопии и сканирующей электронной микроскопии был охарактеризован размер и морфологические особенности наночастиц (рис. 2, 3).
Таким образом, природный полимер - хитозан благодаря регулируемости его основных физико-химических характеристик (М.м., СД ) и индекса полидисперсности является перспективным материалом для формирования наночастиц, различающихся размером и значением поверхностного заряда.
Авторы приносят благодарность В.И. Попен-ко - сотруднику Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской Академии наук за проведение структурных исследований частиц с использованием методов микроскопии, а
также С.А. Лопатину - сотруднику Центра "Биоинженерия" Российской Академии наук за определение индекса полидисперсности образцов гид-ролизатов хитозана методом ВЭЖХ.
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 07-04-12200-офи и 07-04-12112-офи).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ландре Е. // Рос. нанотехнологии. 2007. Т. 2. № 3/4. С. 8-15.
2. Liu C.-G, Desai K.G.H, Chen X.-G., Park H.-J. // J. Ag-ric. Food Chem. 2005. V. 53. № 5. P. 1728-1733.
3. Хитин и хитозан. Получение, свойства, применение / Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П. М.: Наука, 2002. 368 с.
4. Ilium L. // Pharm. Res. 1998. V. 15. № 9. P. 1326-1331.
5. Tsai G.J, Su W.-H. // J. Food Protect. 1999. V. 62. № 3. P. 257-272.
6. Rinaudo M. // Prog. Polym. Sci. 2006. V. 32. № 7. P. 603-632.
7. Wang S.-F, Tan Y.-M. // Anal. and Bioanal. Chem. 2007. V. 387. № 2. P. 703-708.
8. Chen X.-G, Liu C.-S, Liu C.-G. et al. // Biochem. Eng. J. 2006. V. 27. № 3. P. 269-274.
9. Ильина А.В., Варламов В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. № 1. С. 9-16.
10. Ильина A.B., Варламов В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 3. С. 354-358.
11. Ильина A.B., Ткачева Ю.В, Варламов В.П. // Прикл. биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 2. С. 132-135.
12. Peter M.G.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.