научная статья по теме ХЛОРНАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ГАМКАA-РЕЦЕПТОРА СИНАПТОНЕЙРОСОМ ИЗ КОРЫ МОЗГА КРЫС WAG/RIJ С АБСАНС-ЭПИЛЕПСИЕЙ И КРЫС ВИСТАР В РАННЕМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ КИНДЛИНГА И ПОСЛЕ ЕГО ОКОНЧАНИЯ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «ХЛОРНАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ГАМКАA-РЕЦЕПТОРА СИНАПТОНЕЙРОСОМ ИЗ КОРЫ МОЗГА КРЫС WAG/RIJ С АБСАНС-ЭПИЛЕПСИЕЙ И КРЫС ВИСТАР В РАННЕМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ КИНДЛИНГА И ПОСЛЕ ЕГО ОКОНЧАНИЯ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 4, с. 318-323

= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ =

УДК 612.8 + 612.8.015

ХЛОРНАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ГАМКАд-РЕЦЕПТОРА СИНАПТОНЕЙРОСОМ ИЗ КОРЫ МОЗГА КРЫС WAG/Rij С АБСАНС-ЭПИЛЕПСИЕЙ И КРЫС ВИСТАР В РАННЕМ ПЕРИОДЕ РАЗВИТИЯ КИНДЛИНГА И ПОСЛЕ ЕГО ОКОНЧАНИЯ

© 2007 г. И. Г. Ребров1, М. Н. Карпова1, А. А. Андреев1, Н. Ю. Клишина1, Л. В. Кузнецова1, Ж. Ван Луийтеллар2, А. С. Базян3*

1Институт общей патологии и патологической физиологии РАМН, Москва, Россия

2Отделение биологической психологии, N1C1, Университет Наймеган, Нидерланды 3Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва, Россия

Исследовали мусцимол-индуцируемую проводимость 36С1- в синаптонейросомы, препарированные из фронтальной и соматосенсорной коры крыс с тремя типами эпилептической активности: тонико-клонический пентилентетразоловый киндлинг у крыс Вистар, бессудорожный пентилентетразоло-вый киндлинг у крыс Вистар и генетическая модель неконвульсивной абсанс-эпилепсии у крыс WAG/Rij. Были использованы две концентрации мусцимола 30 и 100 ||М. У крыс Вистар выработка киндлинга до тонико-клонических судорог вызывала значительное уменьшение индуцируемой мус-цимолом проводимости 36С1- относительно контрольных крыс. Выработка безсудорожного киндлинга вызывает значительное усиление проводимости 36С1- в синаптонейросомы неокортекса. У контрольных крыс WAG/Rij обнаружено значительное усиление проводимости 36С1- в синаптонейросомы неокортекса относительно контрольных крыс Вистар. Уменьшение индуцируемой мус-цимолом проводимости 36С1- после развития тонико-клонического киндлинга соответствует многим литературным данным, указывающим на уменьшение активности ГАМКА-рецептора при тонико-клоническом киндлинге. Высокий уровень индуцируемой мусцимолом проводимости 36С1- в синаптонейросомы неокортекса крыс WAG/Rij соответствует идее об индуцируемой гиперполяризацией природе абсанс-эпилепсии. Высокий уровень проводимости 36С1- при бессудорожном ПТЗ-киндлин-ге указывает на сходство активности ГАМКА-рецептора в генетической и выработанной моделях абсанс-эпилепсии.

Ключевые слова: абсанс-эпилепсия, пентилентетразоловый киндлинг, мусцимол, проводимости 36СГ синаптонейросомами, неокортекс, ГАМКА-рецептор, 111 канал, крысы WAG/Rij.

Достаточно адекватной моделью хронической эпилептизации мозга является феномен киндлинга, заключающийся в том, что многократное электрическое раздражение некоторых структур мозга подпороговыми стимулами или хроническое системное введение конвульсантов вызывают с течением времени повышение готовности мозга к судорожной реакции на те же воздействия, которые ранее были неконвульсивными [1, 2, 3]. Киндлинг - это модель изучения патологической памяти, сохраняющей программу биохимической дизрегуляции в течение длительного времени [2, 4]. Киндлинг как модель хронической эпилептизации мозга наиболее близка к человеческой эпилепсии и отражает существенные стороны патогенеза эпилептического синдрома, приближая его к клиническим особенностям развития заболевания. В процессе развития хронической

*Адресат для корреспонденции: 117485, Москва, ул. Бутлерова, д. 5А; e-mail: bazyan@mail.ru

эпилептизации мозга - киндлинга - условно можно выделить три стадии:

1-я - ранняя стадия, когда судороги у животных еще не возникли; 2-я - средняя стадия - появление у животных судорог и увеличение их тяжести; 3-я - заключительная стадия - завершается генерализованным тонико-клоническим припадком и выработкой состояния повышенной судорожной готовности мозга, которое сохраняется длительное время после проведения киндлинга [1, 3]. На ранней стадии киндлинга (до появления судорожного синдрома) повторные введения кон-вульсанта пентилентетразола (ПТЗ) вызывают поведенческие (замирания, тремор и т.д.) и ЭЭГ (пик-волновые разряды) изменения, соответствующие проявлениям абсансной формы эпилепсии [5-7]. Заключительная стадия киндлинга представляет собой генерализованные тонико-клони-ческие судороги. Таким образом, процесс киндлинга имеет стадийность, и каждая стадия характеризуется своими присущими ей особенностями.

Развитие киндлинга сопровождается нарушением функционирования многих систем, в том числе, и ГАМК-ергической [3, 8-13], играющей важную роль в деятельности антиэпилептической системы, предотвращающей и подавляющей эпилептическую активность [14, 15].

Абсанс-эпилепсия у человека и крыс линии WAG/Rij, генетической животной модели генерализованной абсанс-эпилепсии человека [16-19], является принципиально другим типом эпилептической активности. Например, ряд широко используемых антиконвульсантов усиливает аб-санс-эпилепсию [20-24]. Серия спонтанно возникающих пик-волновых разрядов проявляется в нормальном ЭЭГ. Пик-волновые разряды индуцируются гиперполяризацией. Ингибиторная фаза отражается в ЭЭГ как медленная волна, а пик отражается как возбуждающий постсинаптиче-ский потенциал и потенциал действия таламо-кортикальных и кортикальных клеток [25, 26].

Задача настоящего исследования состояла в определении особенностей функциональной активности ГАМКА-рецептора (интенсивность хлорного тока) у крыс линии WAG/Rij, генетически предрасположенных к абсансной форме эпилепсии, и крыс линии Вистар на ранней стадии развития киндлинга (абсансная форма эпилепсии) и после его окончания (генерализованные тонико-клонические судороги).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Были исследованы самцы крыс линии Вистар в возрасте 3-4 мес. массой 180-260 г, самцы крыс линии Вистар в возрасте 5-6 мес. массой 290-390 г, а также самцы крыс линии WAG/Rij в возрасте 5-6 мес. массой 290-390 г. Возраст животных 5-6 мес. является оптимальным для развития пик-волновых разрядов у крыс WAG/Rij. Животные были размещены в виварии по 5 животных в клетку, при естественных условиях день и ночь (день приблизительно 8 ч), с непрерывным доступом к воде и пище. Правила работы с животными и протоколы экспериментов утверждены этической комиссией Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.

Выработка киндлинга. Для выработки тони-ко-клонического киндлинга низкую дозу (30 мг/кг) ПТЗ (Sigma, USA) или физиологический раствор (контрольные крысы) вводили внутрибрюшинно ежедневно 3-месячным крысам Вистар. Ежедневное введение ПТЗ градуально повышает чувствительность крыс к конвульсанту и вызывает судороги, которые, нарастая, оканчиваются тонико-кло-ническим пароксизмом. Тяжесть судорог оценивали в баллах: 1 - вздрагивание (кивание) головы; 2 -редкие (отдельные) клонические судороги всего тела; 3 - серия клонических судорог всего тела

или клонус передних конечностей; 4 - тонико-клонические судороги с подъемом на задние конечности (поза "кенгуру"); 5 - тонико-клониче-ские судороги с падением животного на бок. Судороги тяжестью в 4-5 баллов достигаются при ежедневном введении ПТЗ в течение 18-22 сут.

Для выработки ранней бессудорожной стадии киндлинга животным в течение 5 дней внутрибрюшинно вводили ПТЗ в субконвульсивной дозе 25 мг/кг. Контрольным животным в аналогичных условиях опыта в том же объеме вводили физиологический раствор. В опыты по изучению функциональной активности ГАМК^рецептора брали животных, у которых введение конвульсанта ПТЗ в течение 5 дней не вызывало появления судорог.

Синаптонейросомы из фронтальной области коры мозга опытной и контрольной групп крыс выделяли одновременно через 48 ч после последней инъекции ПТЗ. Были исследованы 8 крыс с тонико-клоническим киндлингом и 8 контрольных крыс, 10 крыс с бессудорожным киндлингом и 10 контрольных крыс, а также 6 контрольных 5-6-месячных крыс линии WAG/Rij и 6 контрольных 5-6-месячных крыс линии Вистар.

Выделение синаптонейросом. Синаптонейро-сомы из мозга крыс выделяли методом Холинг-сворта [27] с некоторыми модификациями [28]. Ткань коры мозга (соматосенсорная кора с фронтальной областью) гомогенизировали в ручном стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в холодной (0-4°C) среде Кребса-Рингера, содержащей в мМ: NaCl - 145, KCl - 5, MgSO4 - 1, CaCl2 - 1, glucose - 10, HEPES - 10, pH = 7.4 (при 20°C) в соотношении 1 г ткани к 15 мл среды. Го-могенат последовательно фильтровали через нейлоновую сетку (Рахмановский комбинат, Россия) с размером пор 300, 99, 69 и 27 мк. Фильтрат центрифугировали 5 мин 2700 g, осадок (Px) суспендировали в том же объеме среды Кребса-Рингера и повторно центрифугировали при тех же условиях. Осадок (P2) суспендировали в среде Кребса-Рингера до конечной концентрации синаптонейросом 4 мг белка/мл. Синаптонейросомы использовали немедленно после препарирования.

Исследование проводимости 36Cl~ ГАМКА-ре-цептором синаптонейросом. Порцию суспензии синаптонейросом (100 мкл, 400 мкг белка) инкубировали 30 мин при 20°C и добавляли, быстро перемешивая, 100 мкл среды Кребса-Рингера, содержащей 0.5 мкКю 36Cl- ("Изотоп", Россия) и необходимую концентрацию мусцимола (Sigma, USA). Спустя 5 с пробы фильтровали через GF/C-филь-тры (Whatman, England) с последующей трехкратной промывкой холодной средой Кребса-Рингера (4 мл каждый раз), содержащей 100 мкМ пикро-токсина (Sigma, USA). Радиоактивность фильтров измеряли в сцинтилляторе Брея, используя сцин-

Таблица 1. Проводимость 36С1- (нМоль/мг белка) внутрь синаптонейросом, препарированных из фронтальной коры 3-4-месячных контрольных крыс Ви-стар и крыс Вистар с тонико-клоническим ПТЗ-киндлингом (30 мг/кг, 18-22 сут)

Мусцимол (цМ) Контроль Тонико-клониче-ский киндлинг

0 30.7 ± 0.9 28.7 ± 1.7

30 76.8 ± 2.8х 58.7 ± 0.9*х

100 83.1 ± 3.3х 72.1 ± 2.1*х

* Pf < 0.05 относительно контроля.

x Pf < 0.01 относительно предыдущей концентрации мусци-мола.

Таблица 2. Проводимость 36С1- (нМоль/мг белка) внутрь синаптонейросом, препарированных из фронтальной коры 5-6-месячных крыс Вистар и WAG/Rij

Мусцимол (цМ) Вистар WAG/Rij

0 43.8 ± 2.2 45.9 ± 2.6

30 53.1 ± 3.7х 67.2 ± 3.9*х

100 70.7 ± 3.9х 81.1 ± 3.4*х

* Pf < 0.05 относительно контроля.

x Pf < 0.05 относительно предыдущей концентрации мусци-мола.

Таблица 3. Проводимость 36С1- (нМоль/мг белка) внутрь синаптонейросом, препарированных из фронтальной коры 3-4-месячных контрольных крыс Вистар и крыс Вистар с

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком