БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 6, с. 684 - 692
УДК 577.171.6
HMGA1 - НОВАЯ МИШЕНЬ miR-195, ИГРАЮЩАЯ РОЛЬ В РАЗВИТИИ ГИПЕРТРОФИИ КАРДИОМИОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЗОПРЕНАЛИНОМ
© 2014 Ксянг-Ю Йоу#, Джионг-Хуа Хуанг#, Бин Лиу, Шао-Джун Лиу, Юн Цонг, Ши-Минг Лиу*
Cardiovascular Department, the Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University, Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease, 250 Chang-gang East Road, Guangzhou 510260, PR China; fax: +86(20)3415-3566, E-mail: gzliushiming@126.com
Поступила в редакцию 03.11.13 После доработки 09.12.13
Все больше данных, появившихся в литературе, свидетельствуют о том, что микроРНК (miPHK) играют важную роль в процессе развития гипертрофии миокарда и сердечной недостаточности в постнатальный период. Суперэкспрессия miR-195 в сердце приводит к аномальному росту сердца и сердечной недостаточности у трансгенных мышей. Мы проанализировали роль miR-195 в развитии гипертрофии кардиомиоци-тов и показали, что при гипертрофии кардиомиоцитов, индуцированной изопреналином (ISO), уровень экспрессии miR-195 значительно увеличивается. Анализ мРНК с использованием микрочипов и других методов молекулярной биологии позволил идентифицировать новую потенциальную мишень miR-195 — ген HMGA1 (high-mobility group A1). Анализ препарата тотальной мРНК с использованием микрочипов показал, что в первичных кардиомиоцитах, суперэкспрессирующих miR-195, уровень экспрессии HMGA1 значительно снижен. Используя метод оценки активности люциферазы, показано, что miR-195 взаимодействует с З'-нетранслируемой областью (3'-UTR) мРНК HMGA1. Более того, в первичных кардиомиоцитах miR-195 снижается уровень экспрессии HMGA1 на белковом уровне. Кроме того, miR-195 может снижать уровень экспрессии новой мишени — гена HMGA1, и играть, таким образом, роль в развитии гипертрофии кардио-миоцитов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: микроРНК-195, гипертрофия кардиомиоцитов, мишень микроРНК, HMGA1.
Все многоклеточные эукариотические организмы экспрессируют микроРНК (ш1РНК) — регуляторные РНК длиной ~22 нуклеотида, которые могут снижать уровень экспрессии генов за счет взаимодействия с З'-нетранслируемой областью (З'-иТЯ) специфической матричной РНК (мРНК), приводя к деградации транскрипта или препятствуя трансляции [1, 2]. Гипертрофия сердца является респространенным ответом мио-цитов на разнообразные физиологические и патологические стимулы. Как правило, она сопровождается такими заболеваниями, как ише-мическая болезнь сердца, гипертония и сердечная недостаточность [3]. Все больше данных свидетельстуют о том, что ш1РНК выполняют множество жизненно важных функций в регуляции гипертрофии сердца. МЖ-208 играет
# Авторы внесли одинаковый вклад в выполнение работы.
* Адресат для корреспонденции.
роль в развитии гипертрофии кардиомиоцитов в ответ на стресс и гипотиреоидизм [4]. Ингиби-рование miR-133 приводит к значительной гипертрофии сердца [5]. Суперэкспрессия miR-214, miR-24 и miR-23a в кардиомиоцитах тоже приводит к развитию значительной гипертрофии [6]. MiR-195 также играет роль в развитии гипертрофии сердца и сердечной недостаточности. Суперэкспрессии miR-195 достаточно для того, чтобы индуцировать гипертрофию сердца и сердечную недостаточность у трансгенных мышей [6]. MiR-195 принадлежит к семейству miR-15, в состав которого входят многочисленные miPHK, такие как miR-15a, miR-15b, miR-16, miR-195 и miR-497. MiR-195 содержит характерную для этого класса затравочную последовательность («seed region»), которая захватывает 2—8 нуклеотиды 5'-фрагмента зрелой miPHK. По имеющимся данным, уровень экспрессии представителей семейства MiR-15 увеличивается
в желудочках сердца мышей на 1-й и 10-й день жизни (P1 и P10); представители этого семейства регулируют экспрессию ряда генов клеточного цикла, в том числе гена киназы Chekl (checkpoint kinase 1). Представители семейства MiR-15 регулируют митотический блок постна-тальных кардиомиоцитов. Подавление РНК семейства miR-15 у новорожденных мышей с помощью LNA-модифицированных анти-miPHK (LNA, locked nucleic acids) приводит к увеличению числа делящихся кардиомиоцитов и дереп-рессией Chek1 [7].
Однако роль miR-195 в развитии гипертрофии сердца до конца не ясна. Этот вопрос заставил нас начать поиск новых мишеней miR-195. Целью настоящей работы стала идентификация новых генов-мишеней miR-195, играющих роль в развитии гипертрофии кардиомиоцитов, с помощью ряда методов таких, как анализ мРНК с использованием микрочипов, определение активности люциферазы и Вестерн-блот анализ. Полученные результаты показали, что ген HMGA1 (high-mobility group A1) является новой мишенью miR-195. Суперэкспрессия miR-195 в кардио-миоцитах приводит к значительному снижению количества HMGA1 как на уровне мРНК, так и на белковом уровне. Кроме того, мы проанализировали взаимосвязь между ингибированием HMGA1 и развитием гипертрофии кардиомиоцитов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Первичная культура кардиомиоцитов. Миоци-ты желудочков новорожденных крысят выделяли из желудочков крыс Sprague-Dawley на 1—2 день после рождения согласно протоколу, описанному ранее [8]. Клетки предварительно сажали на 2 ч для увеличения количества кардио-миоцитов, после чего сажали из расчета 1000 клеток/мм2 и растили в модифицированной Дуль-беко среде Игла (DMEM)/M199 (3 : 1), содержащей 5%-ную фетальную бычью сыворотку, 10%-ную лошадиную сыворотку и 100 ^M бро-модезоксиуридина («Sigma»). На второй день после высаживания клетки переносили в DMEM/ /M199, не содержащую сыворотки, и растили еще один день.
Через три дня после высаживания кардио-миоциты обрабатывали 10 ^M изопреналином («Sigma») 48 ч или инфицировали рекомбинант-ными лентивирусами (MOI 100) в течение 6 ч, затем культивировали в среде без сыворотки 42 ч, после чего клетки либо использовали для выделения РНК, либо для иммуноцитохимического анализа. Антитела к актинину («Sigma») использовали в разведении 1 : 500, ядерное окрашива-
ние осуществляли с помощью DAPI-содержаще-го препарата Vectashleld («Vector Laboratories») в качестве заливочной среды.
Конструкция лентивирусов и их наращивание. Первичные кардиомиоциты, суперэкспрессиру-ющие miR-195, были получены путем инфицирования лентивирусами. ДНК пре-miR-195 крыс с -100 п.о. фланкирующих последовательностей с каждой стороны встраивали в лентивирусную плазмиду EF.GFP [9] по сайтам BamHI и NheI. ДНК рre-miR-195 амплифицировали с геномной ДНК крыс с использованием следующих праймеров: 5'-TAAGGATCCACAGGAGACACT-GGAAAGAG-3' и 5' -TAAGCTAGCTGACTTCT-GTCTGATGGACGTT-3'. Делецию затравочной области miR-195 осуществляли с помощиью метода перекрывающейся ПЦР (overlap-PCR method), после чего полученную последовательность встраивали в лентивирусную плазмиду EF.GFP.
Рекомбинантные лентивирусы получали путем котрансфекции клеток 293T тремя плазми-дами EF.GFP, pMD.G и pCMVA8.91 с использованием липофектамина 2000 («Invitrogen») согласно ранее описанному протоколу [9]. Вирусы собирали через 48 и 72 ч после трансфекции и титровали согласно проценту GFP+ клеток после трансдукции рядом последовательных разведений вирусных супернатантов.
Анализ мРНК с использованием микрочипов. Анализ с использованием микрочипов проводили на препаратах РНК, выделенных из первичных кардиомиоцитов крыс, суперэкспрессиру-ющих miR-195, и из контрольных клеток несу-перэкспрессирующих miR-195. Анализ проводила компания «Shanghai KangChen Bio-Tech, Inc.» на 12 x 135 K микрочипах с мРНК крыс («Roche NimbleGen»). Изменение сигнала в 1,5 раза считалось значимым.
Выделение РНК и количественная ПЦР с предварительной обратной транскрипцией (qRT-ПЦР). Препарат тотальной мРНК, включающий miPHK, получали с помощью набора the miRNeasy Mini Kit («Qiagen») согласно протоколу производителя. Синтез кДНК осуществляли с использованием набора Superscript III cDNA synthesis kit («Invitrogen»). Для qRT-ПЦР использовали набор PrimeScript™ RT reagent kit («Takara»). Для анализа miR-195 использовали следующие прай-меры: образующий шпильку праймер для обратной транскрипции 5'-GTCGTATCCAGTGCGT-GTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATAC-GACGCCAATA-3'; праймеры для количественной ПЦР 5'-GGGGTAGCAGCACAGAAAT-3' и 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'. В качестве внутреннего контроля использовали праймеры к GAPDH 5'-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3'
и 5'-GGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'. Для амплификации ANF использовали праймеры 5'-AG-TGCGGTGTCCAACACAG-3' и 5'-CTTCATCG-GTCTGCTCGCT-3'; для амплификации HMGA1 использовали праймеры 5'-CAACTCCGGGGAG-GAAACCA-3' и 5'-AGGACTCCTGGGAGATGC-3'. Относительные уровни экспрессии miR-195, ANF и HMGA1 нормализовали по относительному уровню экспрессии GAPDH методом порогового цикла 2-ЛЛСГ (2-ллсг cycle threshold method).
Дизайн конструкций для анализа активности люциферазы. Последовательность ДНК, кодирующий pre-miR-195 крыс, амплифицировали с геномной ДНК с использованием праймеров 5 ' - CAAGGATCCACAGGAGACAC TG GAAA-GAG-3' и 5'-CAAGAATTCTGACTTCTGTCTGA-TGGACGTT-3' и клонировали в вектор pcDNA3.1+ по сайтам BamHI и EcoRI; полученная конструкция обозначается далее как pcDNA-mir195.
Последовательность, содержащую 3'-нетранс-лируемую область HMGA1, амплифицировали с геномной ДНК с использованием праймеров 5'-AAAGAATTCCCACTTGCAGTGCCGCCT-GCTC-3' и 5'-CAACTCTAGAACAACAAGGGG-AGGTGGTCCTATAC-3' и клонировали в модифицированный репортерный вектор pGL3-con-trol-MCS непосредственно после стоп-кодона гена люциферазы по сайтам EcoRI и Xbal. Плаз-миду pGL3-control-MCS получили путем модификации плазмиды pGL3-control («Promega») путем встраивания сайта множественного клонирования (MCS, содержащего сайты BstXl, EcoRI, EcoRV и A^al) в расположенный выше сайт Xbal [10]. Для делеции сайтов связывания miR-195 использовали перекрывающуюся ПЦР (overlap-PCR), полученные последовательности, содержащие мутации, клонировали в репор-терный вектор pGL3-control-MCS. Точность клонирования встройки дикого типа (wt) и встройки, содержащей мутации (mut), проверяли с помощью секвенирования.
Метод оценки активности люциферазы. Активность люциферазы оценивали в клетках Hela (предоставленных China Center for Type Culture Collection, CCTCC), котрансф
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.