БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2012, том 38, № 3, с. 210-218
УДК 57.054+596/599 ФИЗИОЛОГИЯ
холинергическая регуляция сократительной активности мышц стенки тела АСЦидии STYELA
RUSTICA (LINNAEus, 1767)
© 2012 г. Б. С. Кузьмин, Е. в. волкова, Г. С. Сухова
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет,
Москва 119992 e-mail: ku290381@mail.ru
Статья принята к печати 8.12.2011 г.
Изучены механизмы, опосредующие сократительный ответ мышц стенки тела асцидии Styela rustica. Показано, что ацетилхолин (АЦХ) в концентрации 1-10 мкМ вызывал выраженный сократительный ответ мышечной полоски асцидии. Прозерин (15 мкМ) приводил к пролонгированию эффекта АЦХ, что подтверждено наличием в мышцах S. rustica холинэстеразной активности. В свою очередь, d-тубокурарин (блокатор Н-холинорецепторов), а не атропин (блокатор М-холинорецепторов), снижал эффект экзогенного АЦХ. Таким образом, нервно-мышечная передача у S. rustica, по-видимому, является холинергической и опосредуется Н-холиноподобными рецепторами. Прокаин приводил к подавлению сократительной реакции мышечной полоски, вызванной АЦХ. Установлено, что в изолированных мышечных полосках стенки тела асцидии сохранялась способность к периодическим сокращениям. Спонтанная сократительная активность мышц асцидии, вероятно, имеет миогенную природу, поскольку соединения, способные подавлять нейрогенную активность, не влияли на амплитуду и частоту спонтанного ритма.
Ключевые слова: асцидия, оболочники, мышцы, ацетилхолин, холинергическая регуляция, миогенная активность.
Cholinergic regulation of body wall muscle contraction of the ascidian Styela rustica (Linnaeus, 1767). V. S.
Kuzmin, E. V. Volkova, G. S. Sukhova (M.V. Lomonosov Moscow State University, Biological Faculty, Moscow 119992)
The regulation of the body wall muscle contraction in the ascidian Styela rustica was studied. Acetylcholine (ACh, 1-10 pM) induced a significant contraction of isolated muscle strips. ACh-induced contractile response was potentiated and prolonged in the presence of proserine (15 pM), as was indicated by acetylcholinesterase activity in the S. rustica body wall muscle. Atropine (M-cholinoreceptor blocker) was unable to prevent ACh-induced contractile response, while d-tubocurarine (N-cholinoreceptor blocker) progressively reduced muscle contraction induced by 10 pM ACh. Thus, the neuromuscular transmission in the S. rustica body wall muscle is mediated by the nicotinic-like ACh-receptors. Procaine reduced ACh-induced muscle contraction. Also, our experiments showed spontaneous rhythmic contractile activity in isolated muscle strips of S. rustica. Atropine, d-tubocurarine, procaine, and proserine did not alter rhythmic activity. Myogenic automaticity is suggested as a possible reason of the rhythmic contraction of the ascidian body wall muscle. (Biologiya Morya, 2012, vol. 38, no. 3, pp. 210-218).
Key words: ascidian, tunicates, body wall muscle, acetylcholine, cholinergic regulation, myogenic automaticity.
Представители класса асцидий (Ascidiacea) - широко распространенные морские животные. Экология и морфология этих организмов хорошо изучены, гораздо меньше известно о физиологии асцидий (Millar, 1971; Руперт и др., 2008). В частности, почти не исследованы механизмы регуляции сократительной активности их мышц. Установлено, что мышцы у асцидий богато иннервированы, в мышцах также выявлены синапти-ческие структуры (Day, 1919; Markman, 1958; Mackie, Burighel, 2005). У некоторых представителей оболочников (Tunicata) нервно-мышечная передача обусловлена ацетилхолином (АЦХ), как и в поперечно-полосатой мускулатуре позвоночных (Florey, 1967). Однако информация о рецепторных механизмах, опосредующих этот процесс, недостаточна и противоречива. В одних работах утверждается, что АЦХ в мышечных волокнах действует через М-холинорецепторы, в других - через Н-холинорецепторы (Florey, 1967; Mendes, Zingales,
1972). В ряде публикаций описано влияние АЦХ только на мышечные структуры, определяющие работу сифонов (Scudder et al., 1966; Mendes, Zingales, 1972). Большая часть исследований по физиологии выполнена на Ciona intestinalis (Markman, 1958; Florey, 1963, 1967; Scudder et al., 1966) и на представителях рода Botryllus (Burighel et al., 2001). Практически отсутствуют сведения о механизмах возбуждения и сокращения мышечных клеток у взрослых асцидий.
В связи с вышесказанным целью нашей работы являлось изучение механизмов, опосредующих сократительный ответ мышц стенки тела асцидии Styela rustica, а также холинергической регуляции сократительной активности мышц у этого вида. Известно, что для асцидий in vivo свойственны периодические сокращения мышц стенки тела и сифонов (Руперт и др., 2008). В ходе данного исследования было установлено, что в небольших изолированных мышечных полосках
стенки тела способность к периодическим сокращениям сохраняется. Периодические сокращения, или "автоматическая активность", - широко распространенное физиологическое явление (Коштоянц, 1950; Проссер, 1977). У асцидий механизм, обеспечивающий периодические сокращения мышц, не описан. Одной из задач настоящей работы являлось изучение природы автоматической активности, характерной для мышц стенки тела асцидий.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Эксперименты выполнены на Беломорской биологической станции МГУ (ББС). В работе использовали взрослых особей асцидии Styela rustica, собранных в июле-августе 2009-2010 гг. вблизи ББС (Белое море, Кандалакшская губа, район о-ва Великий) на глубине 10-15 м. Асцидий размером 5-7 см перед опытами выдерживали в проточных аквариумах с морской водой и постоянной аэрацией при температуре 8-12°С. Всего в экспериментах было использовано 60 особей.
Препарирование и регистрация сократительной активности мышц стенки тела асцидии
Асцидию вскрывали вдоль линии, соединяющей сифоны и основание, стенки тела разворачивали и закрепляли в препаровальной ванночке, затем с помощью скальпеля отделяли мышечный слой от мантии. Вырезали мышечную полоску (шириной 0.5 см и длиной 2-3 см) таким образом, чтобы ее длинная ось соответствовала апикобазальному направлению тела асцидии. При этом сокращение препарата практически полностью определялось мышечными волокнами продольного слоя мускулатуры стенки тела асцидии. На оба конца мышечной полоски накладывали лигатуры. Препарат помещали в экспериментальную камеру объемом 30 мл. С помощью лигатуры базальный конец мышечной полоски фиксировали на дне камеры, а апикальный конец прикрепляли к штанге механоэлек-трического преобразователя.
Перед экспериментом на препарат мышцы подавали такую нагрузку, чтобы ее длина приблизительно соответствовала длине мышцы in vivo. Механическую активность регистрировали в изотоническом режиме. Сигнал с механоэлек-трического преобразователя поступал на аналого-цифровой преобразователь E-14-440 (L-Card, Россия, частота оцифровки 1 кГц), а затем на ПК. Запись и анализ данных осуществляли с помощью программы PowerGraph (Научный парк МГУ, ООО "ДИСофт").
Для перфузии мышечной полоски в экспериментальную камеру с помощью перистальтического насоса (Gilson Rabbit) подавали свежую морскую воду или воду, содержащую реактивы, со скоростью 30 мл/мин (температура воды 8-12°C). В этих условиях способность препарата к развитию стабильного сократительного ответа сохранялась в течение 5-6 ч.
После препарирования в течение 1-1.5 ч проводили адаптацию препарата, затем в течение 1 мин осуществляли перфузию морской водой, содержащей определенный реактив. Препарат отмывали в течение 20-30 мин. В ряде опытов определяли влияние биологически активных соединений на сократительный ответ мышечной полоски, вызванный АЦХ (концентрация 10 мкМ).
В работе были использованы следующие реактивы: ацетилхолин, карбахолин, атропин, d-тубокурарин (Sigma-
Aldrich, St. Louis, MO, USA), прозерин и прокаин (Верофарм, Россия).
Статистическая обработка результатов
Для оценки статистической значимости различий при сокращении мышц под действием разных соединений использовали непараметрический критерий Вилкоксона (Т-критерий). Расчет производили в программе Statistica 6. Различия считались достоверными при p < 0.05.
Результаты представлены в виде нормированных значений (длину препарата в контрольных условиях принимали за 100%). На диаграммах представлены средние нормированные значения ± стандартная ошибка среднего значения.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Сокращение мышц стенки тела асцидии при действии холиномиметиков и прозерина
Ацетилхолин в концентрациях 1 и 10 мкМ вызывал выраженный сократительный ответ мышечной полоски стенки тела асцидии: ее длина составляла соответственно 85 ± 9 и 60 ± 15% (укорочение на 15 и 40%) от исходного значения (рис. 1). При отмывке морской водой мышечная полоска возвращалась к начальной длине менее чем за 1 мин.
Карбахолин - негидролизуемый аналог АЦХ - применяли в концентрации 10 мкМ. Сократительный ответ мышечной полоски, развивавшийся при действии карба-холина, по амплитуде был несколько больше (50 ± 20%), чем при действии АЦХ в этой же концентрации (рис. 2). Кроме того, расслабление препарата мышцы при отмывке от карбахолина происходило значительно медленнее, чем при отмывке от АЦХ.
Прозерин - ингибитор ацетилхолинэстеразы - в концентрации 15 мкМ вызывал пролонгирование сократительного ответа мышечной полоски стенки тела асцидии, вызванного АЦХ (10 мкМ). Однако при самостоятельном действии прозерин не оказывал влияния на препарат мышцы асцидии (рис. 3). Пролонгирование сократительного ответа мышцы в присутствии прозерина, по-видимому, обусловлено подавлением ацетилхолинэ-стеразной активности и снижением скорости расщепления АЦХ.
Влияние блокаторов Н- и М-холинорецепторов на сокращение мышц стенки тела асцидии, вызванное АЦХ
Блокатор холинорецепторов М-подтипа атропин в концентрациях 1, 10 и 100 мкМ (1 мин) практически не оказывал влияния на сократительный ответ препарата мышцы асцидии, вызванный АЦХ (10 мкМ, 1 мин) (рис. 4).
В то же время блокатор холинорецепторов Н-подтипа d-тубокурарин (1, 10 и 100 мкМ) дозозави-симо снижал сократительный ответ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.