НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 1-2, с. 132-137
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.814+612.824.1
ХОЛИНЕРГИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС И ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ НЕЙРОНОВ КОРЫ В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО ИНКУБИРОВАНИЯ
© 2008 г. Ю. С. Медникова1*, Н. В. Пасикова1, А. В. Исакова1, Ф. В. Копытова2
1Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 2ГУ НЦ неврологии РАМН
На срезах париетальной коры морской свинки экстраклеточно регистрировали активность нейронов V слоя. Изучали спонтанную активность и реактивность нейронов к ионофоретической аппликации ацетилхолина в температурном диапазоне 25-36°С. Импульсные реакции на подведение ацетилхоли-на и частота спонтанной активности имели одну и ту же динамику развития с ростом температуры инкубационной среды. Обнаружены две температурные зоны, где эффективность холинергической реакции резко переходит на более высокий уровень: при 27-29°С и 34-36°С. Во второй зоне перехода градиент холинергической реакции составил в среднем более чем 200% на 1 град. Высокая эффективность холинергической реакции при 35-36°С сопровождалась достоверным падением амплитуды спайков корковых нейронов, что свидетельствует о наступлении гипоксического состояния, обусловленного искусственной инкубацией.
Ключевые слова: нейроны коры, переживающие срезы, ацетилхолин, спонтанная активность, температура, амплитуда спайков.
Холинергическая реакция корковых нейронов, осуществляемая при взаимодействии ацетилхолина с М-холинорецепторами, приводит к медленно нарастающему и длительно (10 и более с) длящемуся повышению импульсной активности [1, 2]. Вскоре после того, как было обнаружено, что ионный механизм этой реакции состоит в блокаде К+ проницаемости и приводит к повышению удельного сопротивления клеточных мембран [1], была установлена ее связь с уровнем энергетического метаболизма [3]. Значение этого обстоятельства удалось выявить гораздо позднее, когда в силу некоторых теоретических представлений [4] и в результате прямых измерений [5] было сформулировано мнение о том, что рост мембранного сопротивления, вызванный ацетил-холином, должен происходить одновременно практически по всей мембранной поверхности нейрона, независимо от пункта приложения медиатора [4]. Стало очевидным, что для развертывания холинергической реакции необходимо существование внутриклеточного метаболического процесса, протекающего с высокой скоростью, поскольку изменения мембранных свойств нейронов, запускаемые ацетилхолином, завершаются часто в пределах двухсот миллисекунд [2].
Поскольку дополнительный выброс ацетилхолина в коре зарегистрирован как при поддержа-
* Адресат для корреспонденции: 117865, Москва, ул. Бутлерова, д. 5а; тел.: 334-77-89; e-mail: zubkov@mi.ras.ru
нии необходимого уровня бодрствования [6], так и при осуществлении приспособительной деятельности [7], возникло предположение о том, что значительные энергетические потребности мозга млекопитающих [8] связаны с обеспечением холинергической реакции, лежащей в основе практически всех проявлений высших функций центральной нервной системы. Целью настоящей работы было определение температурной зависимости метаболической холинергической реакции, выявление ее температурного оптимума и особенностей взаимодействия с другими метаболическими реакциями мозга.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проведены на срезах париетальной коры мозга морских свинок (масса 200250 г). Срезы толщиной 500 мкм приготавливали из продольного блока коры с помощью вибротома VSL (World Precision Instruments, США). Инкубационная камера, в которую помещали срезы, состояла из двух отсеков с независимым протоком раствора Рингера-Кребса, насыщенного газовой смесью (95% 02 + 5% С02) и состоявшего из (мМ): 124 - NaCl; 2.4 - CaCl2; 1.3 - MgSO4; 5 - KCl; 1.25 - KH2PO4; 26 - NaHCO3 и 10 - глюкозы (рН среды 7.4). Скорость протока составляла 1.53 мл/мин. Предварительный нагрев среды инкубации осуществляли с помощью термостата U1 (VEB, Германия), для тонкого регулирования
А
I " Mill I
Н—Н4-
Б 1-
2 | || I I II 11111 111 "I.....'"'I .....I'
I II II III I INI II I I I I.....I III Nlllll I III! I I I I
1 c
Рис. 1. Появление реакции на ацетилхолин у спонтанно активного и "молчащего" нейронов в двух разных температурных зонах.
А - реакции на ацетилхолин спонтанно активного нейрона при 27.3°С (7) и при 28.1°С (2). Б - реакции на ацетилхолин у низкоактивного нейрона при 33°С (7) и при 34°С (2).
Время действия тока фореза указано под каждой осциллограммой. Величина тока фореза: 60 нА для (А) и 40 нА для (Б).
температуры использовали термостатирующее устройство на основе элемента Пельтье (НПО "Биоприбор", Россия). Температуру среды в экспериментальном отсеке камеры измеряли постоянно электронным термометром (НТЦ "НИКАС", Россия).
В течение всего эксперимента температуру инкубационной жидкости поддерживали на уровне 32-34°С для проведения контрольного тестирования. Охлаждение раствора в экспериментальном отсеке до температуры 24-26°С происходило со скоростью 2°/мин. Повышение температуры осуществляли до уровня 35-37°С.
Для экстраклеточной регистрации импульсной активности и ионофоретического подведения ацетилхолина и глутамата использовали трехствольные стеклянные микроэлектроды с общим диаметром кончика 7.4-8 мкм. Отводящий канал и канал для контроля токового эффекта фореза заполняли 3 М раствором NaCl. Третий канал содержал 2 М раствор ацетилхолинхлорида ("Sigma Chemical Co", США). Канал для контроля токового эффекта часто заменяли каналом для фореза глутамата из 1 М раствора глутамата натрия ("Sigma Chemical Co", США) для идентификации нейронов, не имевших спонтанной активности. Ток фореза ацетилхолина составлял 40-60 нА (положительный полюс внутри электрода), ток фореза глутамата составлял 15-30 нА (отрицательный полюс внутри электрода). Ацетилхолин выводился в течение 4.5 с, длительность тока фореза глутамата составляла 1.0-1.5 с. В периоды
между аппликациями устанавливали удерживающий ток 3-5 нА.
Импульсную активность нейронов с выхода усилителя подавали на осциллограф и записывали на магнитную ленту для последующего компьютерного анализа. В фоне за 5 с до каждой аппликации ацетилхолина или глутамата определяли среднюю амплитуду спайков (от пика до пика) и максимальную текущую среднюю частоту ( из пяти последовательных бинов по 500 мс). Тот же показатель, вычисляемый после подведения ацетилхолина, служил для оценки реакции на ацетилхолин. Достоверность изменений показателей спонтанной и вызванной активности определяли методами непараметрической статистики.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Зарегистрирована активность 40 нейронов париетальной коры, которые при температуре 32-34°С имели спонтанную активность, частота которой колебалась от 0 до 9 имп./500 мс, причем "молчащие" нейроны и нейроны с эпизодической активностью составили около 40%. Нейроны с разным уровнем спонтанной активности по-разному реагировали на ионофоретическое подведение ацетилхолина. У 4 нейронов, имевших спонтанную активность в пределах 2.5-7 имп./500 мс и подвергавшихся гипотермии, реакция на ионофоретическое подведение ацетилхолина появлялась в температурном переходе от 27 до 29°С (рис. 1А). Примерно у половины (9 из 17) "молчащих" ней-
1
2
134
МЕДНИКОВА и др.
г, °С 38
36
34
32
30
28
26
, О
26 28 30 32 34 36 38
г, °С
Рис. 2. Соотношение температур возникновения реакций на ацетилхолин и достоверного увеличения уровня спонтанной импульсации у разных нейронов париетальной коры.
Каждая точка на графике соответствует отдельному нейрону, тестированному аппликацией ацетилхолина при разной температуре инкубационной среды. По оси абсцисс отложена температура возникновения первой достоверно отличной от фона реакции на ацетилхолин, по оси ординат - температура достоверного увеличения уровня спонтанной активности по сравнению с предшествующим измерением, произведенным при температуре на 1° ниже. Различное изображение точек на графике означает, что реакция на ацетилхолин в первой и второй зонах температурного перехода появлялась у разных нейронов. Величина тока фореза ацетилхолина 40-60 нА.
ронов и нейронов с эпизодической активностью (0-0.4 имп./500 мс) реакция на ацетилхолин возникала при нагревании инкубационной среды от 32-34°С до 35-36°С (рис. 1Б), тогда как при охлаждении до 27-29°С у таких нейронов, так же как и при 34°С, реакции на ацетилхолин отмечено не было. Следовательно, экспериментально обнаружены две температурные зоны, в которых наиболее вероятно появление импульсных реакций на подведение ацетилхолина: 27-29°С для спонтанно активных и 34-36°С для спонтанно неактивных нервных клеток.
Обе температурные зоны возникновения реакции на ацетилхолин характеризовались достоверным (критерий Уилкоксона-Манна-Уитни, а < 5%) увеличением уровня спонтанной активности нейронов, как это представлено на рис. 2, где каждая точка на графике, изображающая тестированный ацетилхолином нейрон, указывает одновременно температуру возникновения реакции
на ацетилхолин и температуру достоверного увеличения уровня спонтанной активности. Хорошо видно, что по этим показателям нейроны кластеризуются в двух температурных областях, соответствующих двум температурным зонам возникновения холинергической реакции для спонтанно активных и спонтанно неактивных нейронов.
В группе спонтанно активных нейронов после появления реакции на ацетилхолин при температуре выше 27°С динамика увеличения уровня спонтанной активности и импульсации, возникшей на подведение ацетилхолина, была однотипной и имела небольшой градиент при дальнейшем нагревании до температуры 36°С. В среднем прирост этих показателей составил 12-13% на 1 град. (рис. 3А). В группе нейронов, неактивных при 32-34°С, был зарегистрирован очень значительный рост частоты спонтанной импульсации и интенсивности ответа на подведение ацетилхолина при приближении температуры к нормальным значениям (35-36°С). Вместе с тем выраженность этих изменений была различной у разных нейронов и наряду со значительным приростом уровня спонтанной активности и импульсации в ответ на ацетилхолин (рис. 3Б), у 8 из 17
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.