БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 576.591
ХРОМАТИН СПЕРМАТОЗОИДОВ БЫКОВ НЕ ЗАЩИЩЕН ОТ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАМАЛЫХ НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА
© 2013 г. С. Т. Захидов*, С. М. Павлюченкова*, А. В. Самойлов**, Н. М. Муджири*, **, Т. Л. Маршак**, В. М. Рудой***, О. В. Дементьева***, И. А. Зеленина*, С. Г. Скуридин****, Ю. М. Евдокимов****
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 **Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 117334 Москва, ул. Вавилова, 26 ***Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 31 ****Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 32
E-mail: 4361.idb@bk.ru Поступила в редакцию 19.02.2013 г.
C помощью стандартного метода деконденсации ядерного хроматина in vitro изучена реакция эйя-кулированных сперматозоидов быков на действие наночастиц золота. Показано, что после обработки образцов семени в гидрозоле золота, содержащем наночастицы размером ~3 нм (концентрация 1 х 1015 мл-1), способность ядер сперматозоидов нормально деконденсироваться в ответ на комбинированное действие додецилсульфата натрия и дитиотреитола резко изменяется. При этом в опыте частоты встречаемости гамет с недеконденсированными ("интактными"), частично и полностью деконденсированными ядрами соотносились (в %) как 40 : 32 : 28 против соответственно 0 : 36 : 64 в контроле. Также в популяции обработанных наночастицами золота сперматозоидов отмечено появление сравнительно большого числа гамет с деструктивными, практически полностью распавшимися ядрами. Обсуждаются возможные механизмы действия ультрамалых наночастиц золота на структурно-функциональную целостность дезоксирибонуклеопротеинового комплекса зрелых мужских половых клеток.
DOI: 10.7868/S0002332913060155
В последние годы наночастицы золота занимают видное место в биологических и биомедицинских исследованиях. Предполагается, что наночастицы Au с успехом могут быть использованы для диагностики и лечения некоторых форм рака либо как средство транспортировки генных конструкций и лекарственных веществ к местам назначения со структурно-функциональным дефектом (De et al, 2008; Khlebtsov, Dykman, 2011). Между тем известные на сегодня данные, касающиеся последствий влияния наночастиц Au на живые системы, еще не вполне достаточны для того, чтобы сделать сколько-нибудь надежные выводы относительно их генетической и биологической безопасности.
Ранее нами было показано (Захидов и др., 2010), что в условиях in vitro ультрамалые наночастицы золота размером ~2.5 нм весьма эффективно подавляют процесс деконденсации хроматина в демембранизированных эпидидимальных сперматозоидах мышей. В данной работе объектом действия таких наночастиц золота послужили эйякулированные сперматозоиды быков, структура хроматина которых принципиально отлича-
ется от организации гаметического дезокси-рибонуклеопротеинового комплекса (ДНП-ком-плекса) у мышей. Это касается, по крайней мере, состава протаминоподобных белков и более высокого содержания дисульфидных перекрестных связей, которые делают хроматин сперматозоидов быков сверхустойчивым к действию различных факторов окружающей среды (Perreault etal., 1988; Fuentes-Mascorro et al, 2000; Dadoune, 2003; D'Occihio et al., 2007).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использованы свежезамороженные эйякуляты быков-произволителей. Оценку спер-матотоксичности наночастиц Au проводили c помощью стандартного метода деконденсации ядерного хроматина in vitro.
Наночастицы Au синтезировали тем же методом (Duff et al., 1993), что и использованный нами в предыдущей работе (Захидов и др., 2010). К 45.5 мл деионизованной воды добавили при перемешивании 1.5 мл 0.2 M раствора NaOH, 1 мл водного раствора хлорида тетракисгидроксиметилфосфо-
ния концентрацией 9.6 мг/мл и спустя 5 мин 2 мл 1%-ного раствора HAuCl4. Реакционная смесь мгновенно приобрела темно-коричневую окраску, что свидетельствовало об образовании ультрамалых частиц золота (это подтверждается и отсутствием полосы локализованного поверхностного плазмонного резонанса в спектре поглощения образовавшегося гидрозоля). Средний размер на-ночастиц в полученном коллоидном растворе, определенный методом динамического рассеяния света на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания), составил ~3 нм; числовая концентрация частиц ~1 х 1015 мл-1.
Гидрозоль золота хранили в темноте при температуре 4°C и использовали через 2.5 мес. после приготовления (Yevdokimov et al., 2011). За это время происходила перестройка достаточно дефектной в момент получения структуры наноча-стиц золота ("созревание" гидрозоля), которые приобретали выраженные металлические свойства (Морозов и др., 2012).
Оттаивание спермы, содержавшейся в гранулах, проводили на водяной бане при 37°C, после чего ее разбавляли физиологическим раствором до 3 мл. Полученную суспензию разделяли на две равные части. Чтобы удалить семенную плазму, образцы семени осаждали с помощью низкоскоростного центрифугирования (1600 об./мин, 5 мин). Надосадочную жидкость сливали, а осадки спермиев разбавляли соответственно в 0.5 мл физиологического раствора (контроль) и 0.5 мл "состаренного" в течение 2.5 мес. гидрозоля золота (опыт). Через 20 мин контрольные и опытные образцы сперматозоидов вновь центрифугировали и после удаления надосадочной жидкости в осадки добавляли 1 мл 1%-ного раствора анионного поверхностно-активного вещества — доде-цилсульфата натрия (ДСН) (Sigma, США). Инкубацию контрольных и опытных образцов сперматозоидов в 1%-ном растворе ДСН проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Далее добавляли 0.3 мл 0.01 М раствора дитиотреи-тола (ДТТ) (Sigma), приготовленного на трис-HCl-буфере (pH 8), и продолжали инкубацию в течение 24 ч.
По завершении инкубации бычьих сперматозоидов из контрольных и опытных образцов в растворе, содержавшем ДСН/ДТТ, готовили мазки. Препараты высушивали на воздухе, фиксировали в 96%-ном этиловом спирте в течение 10 мин и окрашивали 0.1%-ным раствором толуидиново-го синего (Fluka, Швейцария). Мазки окрашенных сперматозоидов анализировали с помощью микроскопа Opton (Германия) при общем увеличении х1000, просматривая в среднем 100 случайно выбранных полей зрения.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
По степени разбухания и характеру деконден-сации ядра эйякулированных сперматозоидов в контрольных и опытных образцах семени быков были условно разделены на три основных типа: недеконденсированные ("интактные"), частично деконденсированные и полностью деконденси-рованные (рис. 1а—д). Важно отметить, что в сперматозоидах, взятых из контрольных образцов семени, было обнаружено большое число неде-конденсированных ядер с разнообразными структурными нарушениями (рис. 1е), тогда как в опытных образцах семени, наоборот, преобладали сперматозоиды с развалившимися или почти развалившимися ядрами (рис. 1ж). При сравнительном количественном анализе сперматозоиды с такими атипичными головками не учитывались.
Сводные данные подсчета частоты встречаемости сперматозоидов с разной степенью декон-денсации хроматина графически представлены на рис. 2. В опытных образцах семени процентное соотношение недеконденсированных, частично и полностью деконденсированных ядер составляло 40 : 32 : 28, тогда как в контроле — 0 : 36 : 64. Следовательно, в образцах, подвергнутых 20-минутной обработке наночастицами Au, число сперматозоидов с полностью деконденсированным ядерным хроматином уменьшалось в 2.3 раза по сравнению с контролем.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Известно (Zirkin et al., 1985; Sánchez-Vázquez etal., 1996; Goud et al., 1998; Caglar et al., 2005), что вскоре после проникновения сперматозоида в ооплазму яйца ядро сперматозоида претерпевает сильные структурно-функциональные перестройки: разрушается ядерная мембрана, расщепляются дисульфидные мостики в структуре отцовского генома, молекула ДНК освобождается от спермиоспецифических белков, что в конечном счете приводит к разбуханию и деконденсации ядерного материала. Полная декомпактизация плотноупакованного хроматина — непременное условие формирования мужского пронуклеуса и дальнейшего нормального течения эмбриогенеза. В то же время было установлено (Dadoune, 1995; Zhao et al., 2004; Lamberge, Boissonneault, 2005; D'Occihio et al., 2007; Ward, 2010; Oliva, Ballesca, 2012), что один из важнейших критериев оплодотворяющей способности сперматозоидов — нормальная конденсация хроматина, которая обеспечивается протаминоподобными белками, богатыми аргинином и цистеином. Эти белки, играющие важную роль в формировании мужских гамет, активно синтезируются на постмейо-тических стадиях созревания половых клеток, замещают гистоны соматического и мейотического
! _ чЧ - (а) ,-, (б) 1-1
% *еЯГ (в) , , (г) 1-1
(д) "-" (е) ^
(ж) 1-1
Рис. 1. Недеконденсированные, "интактные" (а), частично (б, в) и полностью (г, д) деконденсированные ядра, а также морфологически аномальные ядра (е, ж) в эйякулированных сперматозоидах быков. а, в, д, ж — после обработки в средах, содержащих наночастицы золота; б, г, е — контроль. Окраска толуидиновым синим. Масштаб: 10 мкм.
типов и образуют прочные комплексы с молекулой ДНК. Благодаря такой интеграции, а также образованию внутри- и межмолекулярных ди-
сульфидных связей за счет окисления сульфгид-рильных групп цистеина ядра зрелых гамет приобретают жесткую кератиноподобную структуру,
% б0
40 -
20 -
Контроль
Опыт
Рис. 2. Частота встречаемости недеконденсирован-ных, "интактных" (1), частично (2) и полностью де-конденсированных (3) ядер эйякулированных сперматозоидов быков.
устойчивую к механическим, физическим и химическим воздействиям. Рыхлость или сверхконденсация генома сперматозоидов и, как следствие, нарушение процессов деконденсации ядерного материала и образования мужского про-нуклеуса in vivo и in vitro указывают на возможность сильных сдвигов в содержании спермио-специфических гистонов и соотношении основных компонентов хроматина, а также появления потенциальных генетических аномалий (Sakkas et al, 1996; Cho et al, 2001, 2003;
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.