научная статья по теме ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДВУХ ДИСКРЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ ЭНЕРГИЗОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ: ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ОДИНОЧНЫХ МИТОХОНДРИЯХ Биология

Текст научной статьи на тему «ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДВУХ ДИСКРЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ ЭНЕРГИЗОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ: ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ОДИНОЧНЫХ МИТОХОНДРИЯХ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 2, с. 135-141

УДК 577.35

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДВУХ ДИСКРЕТНЫХ СОСТОЯНИЙ ЭНЕРГИЗОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ: ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ОДИНОЧНЫХ МИТОХОНДРИЯХ

© 2008 г. Л. С. Ягужинский, Т. В. Вышенская*, А. В. Кретушев**, В. П. Тычинский**

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва, Ленинские горы, тел. (495)930-00-87;

электронная почта: yag@genebee.msu.su *Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, физический факультет, 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ, тел. (495)434-67-92; факс (495)434-86-65; электронная почта: tvysh@yandex.ru **Московский государственный институт радиотехники, электроники и автоматики, 119454 Москва, просп. Вернадского, 78; тел. (495)434-67-92; факс (495)434-86-65; электронная почта: vtych@yandex.ru

Поступила в редакцию 02.11.2007 г.

Методом динамической фазовой микроскопии измеряли рефрактерность мембран одиночных митохондрий. Исследование основано на данных наших предыдущих работ, в которых обнаружено, что приложение электрического поля к искусственным, а также к митохондриальным мембранам вызывает резкое увеличение их рефрактерности. В условиях работы протонных насосов значение рефрак-терности отдельной митохондрии в 2-4 раза превышает среднее значение рефрактерности деэнерги-зованных митохондрий. В настоящем исследовании установлено, что величина мембранного потенциала в энергизованных митохондриях может изменяться в соответствии с внешними условиями; в этих процессах участвует митохондриальная система осморегуляции. Показано, что величина рефрактерности (разность показателей преломления одиночной митохондрии и среды) в случае деэнергизован-ных митохондрий равна 0.02 ± 0.01. Это значение в несколько раз ниже значения рефрактерности энергизованных митохондрий, на мембранах которых есть электрический потенциал. Ранее на модельной мультислойной системе, сформированной из очищенного природного лецитина, показана линейная зависимость рефрактерности этой системы от величины приложенного электрического поля. Существование этой корреляции подтверждает связь между величиной рефрактерности одиночной митохондрии и величиной потенциала на мембране митохондрии, возникающего при работе протонных комплексов. При нормальных условиях (тоничность среды инкубации 250 мОсм) митохондрия ведет себя как динамическая система, которая осциллирует в минутной шкале между двумя состояниями с разными значениями рефрактерности (согласно вышесказанному, с разной величиной мембранного потенциала). Время перехода между этими состояниями 10-30 с, время жизни каждого состояния - несколько минут. Построение гистограмм, характеризующих распределение значений рефрактерности отдельных энергизованных митохондрий в популяциях, состоящих из 20-30 органелл, позволило идентифицировать два отдельных пика (фракции II и III) со средними значениями рефрактерностей 0.05 ± 0.01 и 0.09 ± 0.01 соответственно. Эти фракции соответствуют двум долгоживущим состояниям митохондрий. В гипотонических условиях (120 мОсм) идентифицировано только одно "статическое" состояние митохондрий, при котором отсутствуют осцилляции, и рефрактерность митохондрий в популяции не превышает 0.05 ± 0.01 (фракция II). Измерения на митопластах доказали, что наблюдаемые на митохондриях значения рефрактерности связаны с внутренней митохондриальной мембраной. Сделан вывод о существовании двух дискретных состояний митохондрий. При регистрации быстрых низкоамплитудных флуктуаций рефрактерности отдельных митохондрий в спектрах обнаружены частотные компоненты в интервале 1-3 Гц. Высказано предположение, что появление этих частот определяется неравномерностью процесса функционирования протонных насосов митохондрий: при функционировании АТР-азного насоса наблюдаются частотные компоненты в диапазоне 1.8-2.4 Гц, а при функционировании дыхательных протонных насосов преобладают частоты 1-1.3 Гц.

В настоящее время принято считать, что многие мультиферментные системы могут функционировать в двух состояниях - в диссоциированном и в состоянии суперкомплекса (метаболона). Данные, полученные к настоящему времени, свидетельствуют о том, что мультиферментный комплекс окислительного фосфорилирования в митохондриях может функционировать в двух качественно раз-

личных режимах [1-6]. Переход между этими режимами контролируется системой митохондриальной осморегуляции [1, 7]. Эти работы показали, что противоречие между моделями протонного сопряжения дыхания и фосфорилирования в митохондриях, предложенными П. Митчелом [8] и Р. Вильямсом [9], является мнимым. Оказалось, что в одних условиях (в изотонических средах ин-

кубациии митохондрий) система сопряжения работает согласно П. Митчелу - в режиме делокализо-ванного сопряжения [8], когда ферменты диссоциированы и функционируют как независимые элементы. В других условиях (при низкоамплитудном набухании митохондрий, в гипотонических средах) образуется суперкомплекс, и система окислительного фосфорилирования, согласно Р. Вильям-су, функционирует, как единая структурная единица [9]. В последнем случае с помощью электронной микроскопии зарегистрировано сильное сжатие крист [2] и с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов в таких условиях нам удалось зарегистрировать перестройку внутренней мембраны интактных митохондрий, при которой в митохондриях возникает новая структура. Часть крист при этом переходит в правильные плоские трехмерные образования [10-12], которые дают интерференционную картину нейтронного рассеяния. В настоящей работе использован метод динамической фазовой микроскопии (ДФМ), разработанный в МИРЭА [13], позволяющий регистрировать фазовую высоту и рассчитывать рефрактерность одиночной митохондрии (см. Экспериментальную часть) Опыты на одиночных митохондриях проводились ранее другими авторами [14, 15]. В предыдущих работах нами обнаружен эффект увеличения фазовой высоты одиночных митохондрий, обусловленный образованием на их мембране электрического потенциала Качественное описание этого эффекта приведено в работах [16, 17]. В качестве контроля была измерена рефрактерность модельной мультислойной системы, сформированной из очищенного яичного лецитина, и показано, что так же, как в случае митохондрий, этот параметр увеличивается при наложении постоянного электрического поля. Величина этого эффекта прямо пропорциональна величине приложенного поля [18].

Цель настоящей работы - на одиночных митохондриях получить строгое доказательство возможности существования двух вышеуказанных, качественно различных состояний фосфорилиру-ющей системы, которые реализуются при разных значениях тоничности среды инкубации митохондрий. В данной работе исследованы изменения мембранного потенциала в условиях перехода системы окислительного фосфорилирования из режима делокализованного сопряжения [8] в режим локального [9] сопряжения.

Опыты на митопластах поставлены с целью доказательства гипотезы о том, что наблюдаемое увеличение фазовой высоты (рефрактерности) митохондрий при включении работы протонных насосов связано с внутренней митохондриальной мембраной.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Митохондрии печени крысы выделяли по стандартной методике [19]. Митопласты получали из митохондрий печени крысы согласно [20].

Исходный состав среды инкубации (изотоническая среда): 0.2 M сахароза, 30 мМ трис, 10 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, 10 мМ KCl, 250 мкМ EDTA, pH 7.4. Гипотоническая среда инкубации: 0.07 М сахароза, 30 мМ трис, 10 мМ KH2PO4, 1 мМ MgSO4, 10 мМ KCl, 250 мкМ EDTA, pH 7.4.

Деэнергизацию митохондрий (подавление окисления эндогенных субстратов) проводили добавлением 1 мкМ ротенона или 1 мкМ олигомици-на. Для генерации потенциала в присутствии ротенона вводили 0.2 мМ ATP. Использовали среды инкубации с нормальной (250 мОсм) и сниженной (120 мОсм) тоничностью. Использовали КС1, КН2РО4 ("Helicon", Россия), бычий сывороточный альбумин, ротенон, миксотиазол, олигомицин, трис, EDTA, MgSO4 ("Sigma", США).

При приготовлении образца 2 мкл суспензии митохондрий (1 мг белка/мл) помещали в камеру, состоящую из полированной подложки и покровного стекла, разделенных зазором 5 мкм. Измерения производили при комнатной температуре с помощью когерентного фазового микроскопа "Эйрискан" (МИРЭА, Россия). Для объектива Olympus 50х/0.65 размер поля фазового изображения составлял 4.6 х 4.6 мкм. В каждом образце анализировали 20-30 случайно выбранных митохондрий. (Проводили 10 повторных измерений рефрактерности каждой митохондрии, построение гистограмм повторяли на трех-четырех препаратах митохондрий.) Во всех случаях получены качественно сходные результаты. На рисунках приведены неусредненные характерные гистограммы, полученные в одном из нескольких экспериментов; усредненные значения рефрактерности фракций I-III приведены в тексте. (То же самое относится к записям динамики изменения рефрактерности митохондрий.) На рис. 1 показано поперечное сечение митохондрии, где Ah - максимальное значение ее фазовой толщины, а d - ее диаметр. В предположении сферической формы объекта, когда его физическая (геометрическая) толщина H ~ d равна поперечному размеру, фазовая толщина объекта прямо пропорциональна его рефрактерности An -разности показателей преломления объекта и внешней среды: Ah = dAn.

В случае изучения быстрых низкоамплитудных флуктуаций рефрактерности поперечный профиль митохондрии сканировали многократно (рис. 1) c задержкой 30 мс. Расчет рефрактерности проводили для каждого из записанных диаметральных профилей в сферическом приближении An(t) = = Ah(t)/d^B(t), где Ah(t) - максимальная фазовая толщина митохондрии в момент времени t. В при-

ближении 4>кв(0 = S(t)/Ah(t), где S(t) = J h (x, t)dx -

площадь фазового профиля, текущее значение ре-фрактерности можно определить отношением An(t) = Ah(t)2/S(t).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для установления связи между функционированием протонных насосов, создающих электрохимический потенциал на мембране митохондрии, и наблюдаемыми значениями рефрактерности был проведен эксперимент на одиночной мито

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком