Маркарян А.А., доктор фармацевтических наук, профессор, зав. кафедрой Пешкова Я.В., соискатель Красильникова К.А., кандидат фармацевтических наук, зам. декана (Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова)
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В СБОРЕ «ГАСТРОФИТ»
МЕТОДОМ ВЭЖХ
Разработан и исследован сбор «Гастрофит», применяемый при лечении и профилактике заболеваний желудочно-кишечного тракта. Целью данной работы было качественное исследование фе-нольных соединений сбора, как превалирующей группы, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Ключевые слова: фенольные соединения, гастрофит, сбор, высокоэффективная жидкостная хроматография.
IDENTIFICATION PHENOLIC BONDS THE COLLECTING «GASTROFIT» A METHOD OF A HIGHLY EFFECTIVE LIQUID CHROMATOGRAPHY
We have developed and investigated the collecting "Gastrofit" applied at treatment and prophylaxes of diseases of a gastroenteric tract. Research ofphenolic bonds of the collecting, as prevailing group, a method of a highly effective liquid chromatography was the purpose of the given work qualitative.
Keywords: phenolic bonds, gastrofit, the collecting, a highly effective liquid chromatography.
В общей структуре заболеваний, регистрируемых у человека, одно из ведущих мест занимает язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки. Несмотря на значительные успехи в профилактике и лечении язвенной болезни, улучшении условий жизни и питания, в ХХ веке произошел значительный рост заболеваний органов желудочно-кишечного тракта, как в России, так и в странах Запада.
Несмотря на наличие более 500 лекарственных препаратов, предназначенных для лечения данной нозологической формы, терапия язвенной болезни остается одной из сложнейших и актуальных проблем гастроэнтерологии.
Учитывая многофакторность этиологии, незыблемым остается принцип комплексности лечения. В связи с этим разработка комплексного растительного препарата, обладающего высокой фармакотерапевтической эффективностью, низкой токсичностью, мягкостью действия, является актуальной проблемой современной гастроэнтерологии [6].
Целью нашей работы являлось разработка методики обнаружение фенольных соединений в сборе «Гастрофит» методом ВЭЖХ [1-5] для последующего ее включения в нормативную документацию.
Сбор «Гастрофит» разработан на основе корней ревеня дланевидного, корневищ и корней имбиря лекарственного, корневищ и корней кровохлёбки лекарственной, корневищ и корней девясила высокого. Основными действующими вещества, содержащимися в сборе, являются фенольные соединения, среди которых наибольшее значение имеют галловая, хло-рогеновая, цикориевая кислоты, рутин, кверцетин и некоторые другие.
Подбор оптимальных условий пробоподготовки
Для выбора оптимальных условий экстракции фенольных соединений из сбора было исследовано влияние ряда факторов: степени измельчения сырья, характера экстрагента, температуры, продолжительность экстракции, соотношение сырья и экстрагента.
Важным фактором, влияющим на интенсификацию диффузии и повышение выхода действующих веществ, является степень измельчения сырья. При большой степени измельчения увеличивается площадь соприкосновения с экстрагентом, что приводит к увеличению экстракции. Однако при получении сверхтонких порошков разрушается большое число клеток растительного материала, что приводит к вымыванию из клеток макромолекул белков, полисахаридов, камедей, пектинов, сильно затрудняющих анализ и приводящих к быстрому выходу из строя хроматографической колонки.
Полученные данные показывают, что оптимальная экстракция целевых БАВ из сырья достигается при размере частиц сырья 2 мм (табл. 1).
Для обеспечения температурного режима экстракции оправдано применение водяной бани с обратным холодильником (табл. 2).
Наиболее широко применяемыми экстрагентами являются вода, спирт этиловый, спирто-водные смеси, спирт метиловый, буферные растворы. Результаты количественного определения суммы фенольных соединений в зависимости от используемого экстрагента представлены в табл. 3.
Для установления оптимального соотношения сырья и экстрагента были проведены эксперименты при соотношении 1:5, 1:10, 1:25, 1:50, 1:100, полученные данные представлены в табл. 4.
Как показывают результаты эксперимента, оптимальным соотношением «сырье-экстрагент» является 1:10. Дальнейшее увеличение этого соотношения нецелесообразно, так как не влияет на выход БАВ, но увеличивает расход экстрагента.
Полученные данные свидетельствуют о том, что максимальный уровень суммы феноль-ных соединений в извлечении наблюдается при экстрагировании сбора 70% спиртом этиловым на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 1 ч при соотношении сырья и экстрагента 1:10.
Результаты и обсуждения
Изучение качественного состава фенольных соединений сбора проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON», модель 305 (Франция); с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Муль-тихром для «Windows».
Методика проведения эксперимента
В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6х250 мм Kromasil C 18, размер частиц 5 микрон.
В качестве подвижной фазы - метанол - вода - фосфорная кислота концентрированная (18:82:0,5). Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,8 мл/мин. Продолжительность анализа 70 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151 при длине волны 280 нм.
Аналитическую пробу сбора измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм по ГОСТ 214-83. Около 10,0 г сбора помещали в колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового 70%, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртовод-ной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объёмом 100 мл и доводили спиртом этиловым 70% до метки (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в 70% спирте этиловом: рутина, кверцетина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хло-рогеновой кислоты, гиперозида, геспередина, апигенина, феруловой кислоты, витексина, ро-бинина, 6-гингерола, эллаговой кислоты, цикориевой кислоты, эпикатехина, неохлорогено-вой кислоты.
По 20 мкл исследуемых растворов и растворов сравнения вводили в хроматограф и хро-матографировали по выше приведенной методике.
В результате исследований обнаружены эллаговая, галловая, хлорогеновая, неохлороге-новая, кофейная и цикориевая кислоты, рутин, гингерол, лютеолин, кверцетин, апигенин (рис.1).
Выводы: Разработана методика обнаружения фенольных соединений в сборе «Гастро-фит» методом ВЭЖХ. Результаты исследования будут включены в нормативную документацию на продукт «Гастрофит».
Таблица 1
Зависимость содержания суммы фенольных соединений от степени измельчения
Степень измельчения, мм Содержание суммы фенольных соединений, %
0,5 5,30
1 5,46
2 5,69
3 5,49
5 5,47
7 5,46
Таблица 2
Зависимость содержания суммы фенольных соединений от температуры и времени __экстракции_
Время экстракции Содержание суммы фенольных соединений в сборе, %
Настаивание при 20 °С Нагревание на кипящей водяной бане с обратным холодильником
15 мин - - 4,35
30 мин - - 4,55
60 мин - - 4,75
90 мин 4,10 4,12 4,74
120 мин 4,11 4,15 4,74
Таблица 3
Влияние экстрагента на содержание суммы фенольных соединений_
Экстрагент Содержание фенольных соединений в сборе, %
Вода очищенная -
30% спирт этиловый 4,00
40% спирт этиловый 4,10
50% спирт этиловый 4,11
60% спирт этиловый 4,38
70% спирт этиловый 4,75
90% спирт этиловый 4,57
96% спирт этиловый 4,16
100% спирт метиловый 4,50
100% н-бутиловый спирт 4,14
100% спирт изопропиловый 4,50
50% спирт изопропиловый 4,35
Таблица 4
Зависимость содержания суммы фенольных соединений от соотношения сырья и __экстрагента_
Соотношение сырья и экстрагента Содержание фенольных соединений в сборе, %
1:5 4,45
1:10 4, 7
1:25 4,7
1:50 4,7
Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ извлечения из сбора 70% спиртом этиловым.
Пик 1 - Эллаговая кислота, время удерживания - 2,75; 2 - Галловая кислота, время
удерживания - 3,88; 3 - Хлорогеновая кислота, время удерживания - 4,24; 3 - Неохлороге-
новая кислота, время удерживания - 5,35; 4 - Кофейная кислота, время удерживания - 6,18;
6 - Цикориевая кислота, время удерживания - 7,98; 8 - Рутин, время удерживания - 16,70;
10 - Гингерол, время удерживания - 24,34; 13 - Лютеолин, время удерживания - 35,80;
14 - Кверцетин, время удерживания - 36,35; 22 - Апигенин, время удерживания - 63,12.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алексеева М.А., Эллер К.И., Арзамасцев А.П. Определение пренилированных флавонои-дов хмеля и фитопрепаратов на его основе с помощью обращенно-фазной ВЭЖХ //Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.- М.: 2004.- №3. -С.45-48.
2. Вичкуткина Е.А., Брюханов В.М., Зверев Я.Ф. и др. Определение фенольного состава водного извлечения из оригинального сбора //Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования: сборник научных трудов конференции, посвященной 25-летию фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2006. - С.127-130.
3. Жукова О.Л., Абрамов А.А., Даргаева Т.Д., Маркарян А.А. Изучение фенольного состава подземных органов сабельника болотного. //Вестник Московского Ун-та. Сер.2.Химия. -2006. - Т.47, №5. - С.342.
4. Ломбоева С. С., Танхаева Л.М., Оленников Д.Н. Методика количественного определения
суммарного содержания флавоноидов надземной части ортилии однобокой. /Химия, Технология, медицина. Сборник научных трудов, посвященный 70-летию Всероссийского научно-исследовательского Института лекарственных и ароматических растений -Москва, 2006 - С.319
5. Маршалкин М.Ф., Саенко А.Ю., Гаврилин М.В., Куль И.Я. Определение содержания аминокислот и флавоноидов в траве овса посевного. //Вопросы питания -2006 г., № 3 - С.8.
6. Николаев С.М., Даргаева Т.Д., Российска
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.