= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 606:57.063.8:575:57.082.13
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИ И ГЕНЕТИЧЕСКИ БЛИЗКИХ ВИДОВ LACTOBACILLUS НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ 16S rRNA, groEL, rpoB И rplB
© 2011 г. А. Б. Шевцов*, А. Р. Кушугулова**, И. К. Тыныбаева**, С. С. Кожахметов**, А. Б. Абжалелов**, К. Т. Момыналиев*, Л. Г. Стоянова***1
*РГП "Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан"КНМОНРК, Астана, Казахстан **РГП "Республиканская коллекция микроорганизмов" КН МОН РК, Астана, Казахстан ***Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Россия Поступила в редакцию 24.05.2010 г.
Из национальных молочнокислых напитков кустарного производства (айрана, кумыса, курунги, шуба-та) разных районов Республики Казахстан и Бурятского округа России были выделены и идентифицированы 68 культур молочнокислых бактерий. Культуры молочнокислых бактерий рода Lactobacillus классическими микробиологическими методами и на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S rRNA были идентифицированные как L. paracasei и L. rhamnosus, близкие к группе L. casei, и как L. brevis, L. buchneri, L. diolivorans, L. parabuchneri (группа L. buchneri). Для внутривидовой дифференциации лактобацилл изучен полиморфизм нуклеотидных последовательностей генов groEL, rpoB и rplB, кодирующих специфические белки. Анализ этих генов позволил более точно идентифицировать лактобациллы, генетически и фенотипически близкие к группе L. casei как: L. paracasei sub-sp. paracasei, L. paracasei subsp. tolerans. Нуклеотидные последовательности генов всех генотипирован-ных штаммов были депонированы в GenBank.
Ключевые слова: национальные кисломолочные напитки, идентификация, генотипирование, Lactobacillus, гены 16S rRNA, groEL, rplB, rpoB.
Традиционные кисломолочные продукты смешанного молочнокислого и спиртового брожений, изготовленные по старинным традиционным рецептам на основе верблюжьего (шубат), кобыльего (кумыс), и коровьего (курунга) молока, издавна широко использовались многочисленными народами не только как продукты питания, но как лечебно-профилактические и лечебные средства при заболеваниях сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, желудочно-кишечных инфекциях [1, 2]. В настоящее время интерес исследователей к этим напиткам, видовой состав микробиоты которых сформирован естественным путем, резко возрос. Эти уникальные природные консорциумы служат одним из основных субстратов получения бактериальных культур с ценными свойствами для создания новых продуктов питания, пробиотиков, консервантов. Идентификация молочнокислых бактерий только на основании морфологических, культураль-ных, физиолого-биохимических признаков в настоящее время является недостаточной, поскольку под воздействием различных факторов многие виды обладают высоким уровнем фенотипической изменчивости [3]. Молекулярно-генетические методы идентификации зарекомендовали себя как надежные и независящие от внешних факторов. Высокая
1 Адрес для корреспонденции: (e-mail: stoyanovamsu@mail.ru).
стабильность нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA не позволяет однозначно идентифицировать близкородственные виды. Среди лактобацилл встречаются многочисленные виды и подвиды филогенетически близких групп L. casei, L. plan-tarum, L. buchneri, L. acidophilus, трудно поддающихся точной дифференциации, что приводит к поиску новых генетических маркеров. Для применения анализа нуклеотидной последовательности в целях видовой идентификации рекомендовано использовать маркерные гены, анализ нуклеотидных последовательностей которых позволяет оценить генетическое родство всего генома в этой группе микроорганизмов [4, 5]. Важное значение лактобацилл в пищевой и медицинской промышленности в качестве стартерных культур и пробиотических штаммов требует особого внимания к их правильной таксономической идентификации, так как это является основным доказательством безопасности продуктов, в состав которых входят живые микроорганизмы или продукты их жизнедеятельности.
Целью настоящей работы являлась идентификация генетически и фенотипически близких видов лактобацилл, выделенных из национальных кисломолочных напитков, с использованием анализа нук-леотидной последовательности генов groEL, rpoB и rplB в сравнении с идентификацией только на основе нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
659
6*
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследовании были использованы 68 штаммов микроорганизмов, 66 из которых были представлены молочнокислыми бактериями рабочей коллекции ДГП "Республиканская коллекция микроорганизмов" НЦБ КН МОН РК и были выделены из традиционных напитков Казахстана (кумыс, шубат, айран), и 2 штамма были выделены из бурятского национального кисломолочного продукта курунги. Лактококки культивировали в статических условиях в стерильном обезжиренном молоке (обрате) при 30°С [6], а лактобациллы культивировали в анаэробных условиях в пробирках с жидкой средой МРС под слоем столбика голодного агара при 37°С в течение 36—120 ч. Затем из серии разведений, выросших в МРС культур бактерий, делали высев на агаризованную МРС среду, содержащую 1.5% агара. Перед идентификацией выделенные изоляты были пассированы дважды и инкубированы в течение 18—24 ч в тех же условиях. Морфологию штаммов изучали в световом микроскопе МБИ-15. Для этого готовили фиксированный окрашенный препарат. Руководствуясь перечнем культуральных признаков для идентификации бактерий, их оценивали по росту изолятов в жидких средах с разным содержанием хлористого натрия 4.0 и 6.5%; при рН 5.5 и 9.6; при 10°С и 45°С, а также по форме колоний на твердых агаровых средах [7].
Все культуры были идентифицированы классическими микробиологическими методами: по куль-туральным признакам, морфологии, окраске по Граму, подвижности клеток, наличию каталазы и спектру сбраживаемых углеводов [8]. Молекуляр-но-генетическая идентификация была проведена на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA, используя программное обеспечение MegAlign 6.00 DNASTAR Inc.
ДНК выделяли из суточных культур, инкубированных при 37°С на среде MRS 1 ("HiMedia"), методом Kate Wilson [9]. Амплификация фрагмента 16S rRNA гена была выполнена по методике Vëgas E.Z.S. [10]. Амплификация гена groEL была выполнена с использованием праймеров и условий, предложенных Dellaglio и соавт. [11], а гена rplB — по условиям Diancourt и др. [12]. Амплификация rpoB гена была выполнена с праймерами For—rpoB 5'-TAACCGTGGTGCTTGGCTDGAATWYGAAAC-3' и Rev-rpoB 5'-ATCAAACCAATGTTAGGNCCT-TCWGGDGTTTC-3'. Реакция была выполнена в общем объеме 30 мкл. ПЦР смесь содержала 150 нг ДНК, 1 Ед. Maxima Hot Start Taq-DNA Polymerase ("Fermentas"), 0.2 mM каждого дНТФ, 1-х ПЦР буфер ("Fermentas"), 1.5 mM MgCl2, 15 пмоль каждого праймера. Программа ПЦР амплификации включала длительную денатурацию 95°С в течение 7 мин; 30 циклов: 95°С - 50 сек, 59°С - 60 сек, 72°С -90 сек; заключительная элонгация 7 мин при 72°С, ПЦР программа была выполнена с применением
амплификатора DNA Engine Tetrad 2 Cycler PTC-0240 ("Bio-Rad").
Очистку ПЦР продуктов от праймеров и дНТФ проводили ферментативным методом [13]. Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye(r)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit ("Ap-plide Biosystems") согласно инструкции производителя с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе 3730x1 (DNA Analyzer, "Applide Biosystems").
Нуклеотидные последовательности были проанализированы и объединены в общую последовательность в программном обеспечении SeqScape 2.6.0 ('Applide Biosystems"). Все последовательности, полученные в данном исследовании, были депонированы в GenBank под соответсвующими номерами.
Нуклеотидные последовательности 16S rRNA гена были идентифицированы с применением программного обеспечения MicroSeqID ("Applide Biosystems") и GenBank. Филогенетический анализ проводили с использованием программного обеспечением Mega 3.1 [14]. Выравнивание нуклеотид-ных последовательностей проводили, используя алгоритм ClustalW [15]. Для построения филогенетических деревьев использовали алгоритм Neighbor-Joining (NJ) [16]. Дополнительно в анализ были включены нуклеотидные последовательности близкородственных видов филогенетической группы L. casei: L. paracasei и L. rhamnosus, а также L. sakei, L. plantarum, L. reuteri, L. buchneri, депонированные в международных базах данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенной классической микробиологической идентификации 61 изолят были дифференцированы и отнесены к 14 видам Lactobacillus spp., а 1 изолят был идентифицирован как Lac-tococcus lactis subsp. lactis. Результаты фенотипиче-ской идентификации отображены в табл. 1 и 2. Из кумыса были выделены 31 штамм, из шубата и айрана выделены и идентифицированы 35 штаммов, из бурятского национального молочного напитка курунги были выделены мезофильные лактококки L. lactis subsp. lactis штамм К-205 (GenBank № EF114305) [2] и лактобациллы.
Все изоляты были представлены грамположи-тельными неподвижными клетками, хорошо росли в присутствии 4.0% NaCl, при 6.5% NaCl рост отсутствовал. Лактобациллы, в отличие от L. lactis subsp. lactis, не росли при 10°С, слабо росли при 15°С, снижали рН среды с 5.5 до 4.0. При сбраживании глюкозы лактобациллы образовывали пузырьки газа СО2 (табл. 1).
По результатам анализа нуклеотидной последовательности гена 16S rRNА к роду Lactobacillus было отнесено 67 штаммов. Из них 43 штамма были отнесены к филогенетической группе L. casei (L. paracasei — 35 штаммов, L. rhamnosus —
Таблица 1. Дифференцирующие признаки Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactobacillus spp., выделенных из курунги
Признаки L. lactis subsp. lactis Lactobacillus spp.
Преимущественное расположение клеток Цепочки до 8 кокков Длинные тонкие палочки, одиночные или образуют короткие цепочки
Подвижность - -
Рост при 10°С + -
Рост при 45°С - +
рН 9.6 - -
рН 5.5 + +
Рост в присутствии 4% №С1 + +
Рост в присутствии 6.5% №С1 - -
Образование газа при сбраживании глюкозы - +
Примечание. Знак "+" означает наличие признака, знак "
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.